建立并表征一种新的永生化人口腔角质形成细胞（HOK）细胞系，该细胞系携带多种TP53突变

《Oral Oncology》：Establishment and characterization of a new immortalized human oral keratinocyte (HOK) cell line harboring various TP53 mutations

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中TP53突变与化疗耐药性及侵袭性的关联研究，通过构建携带不同TP53突变（包括高风险C238F）的iHOK细胞模型，发现高风险突变显著增强侵袭性和耐药性，WGCNA分析揭示其调控促转移通路和应激反应，为精准治疗提供新靶点。

　　

赵梅|刘志毅|川边睦月|阿卜杜拉·A·奥斯曼|米切尔·J·弗雷德里克|杰弗里·N·迈尔斯

美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心头颈外科

摘要

头颈鳞状细胞癌（HNSCC）的特征是频繁发生TP53突变，其中一些突变具有功能获得（GOF）特性，会促进肿瘤进展和化疗耐药性。尽管从口腔癌前病变（OPL）到侵袭性和转移性HNSCC的多项基因组研究表明TP53的丢失或突变在HNSCC发生过程中较早出现，但至今仍难以明确这种肿瘤抑制因子的突变如何进一步驱动肿瘤细胞进化并影响肿瘤微环境，从而推动肿瘤进展。为了解决这一问题，我们建立了表达野生型TP53和TP53突变形式的人口腔角质形成细胞（iHOK）永生化细胞系，以研究这些突变如何影响HOK的功能和基因组特征，进而推动其向肿瘤细胞的转化。

我们构建了一系列携带不同TP53突变的iHOK细胞系，其中包括高风险的C238F突变体。关键研究结果表明，高风险细胞系表现出比低风险细胞系更强的侵袭性和化疗耐药性。加权基因共表达网络分析（WGCNA）将高风险突变与促转移通路和应激反应特征联系起来，其中C238F细胞系在p53相关功能获得机制方面具有独特性。相比之下，低风险细胞系仍保持对化疗的敏感性。

这些发现强调了针对特定突变的iHOK模型在确定驱动侵袭性和药物耐药性的转录组事件方面的临床意义，并为干预这些表型提供了方法。通过模拟患者肿瘤中观察到的TP53多样性，这一细胞系模型填补了头颈癌发生研究中的关键空白，使得能够从机制层面解析功能获得表型，并在多种TP53突变细胞模型中进行临床前评估。其重要性在于提供了一个经过验证的、注释丰富的资源，加速了药物发现过程，并阐明了TP53突变亚型在HNSCC发展和进展中的作用，为未来针对遗传复杂恶性肿瘤的转化研究提供了框架。

引言

头颈鳞状细胞癌（HNSCC）是全球第六大常见恶性肿瘤，每年新增病例超过80万例[1]。尽管多模式治疗方法有所进展，但晚期HNSCC的5年生存率仍低于50%，主要原因是肿瘤复发、转移和治疗耐药性[2]。HNSCC的一个显著特征是TP53基因的频繁突变，该基因是调节基因组稳定性、细胞凋亡和应激反应的肿瘤抑制因子。超过70%的HNSCC肿瘤携带TP53突变，这些突变与不良预后、侵袭性强和治疗效果差密切相关[[3], [4], [5]]。与功能丢失突变不同，某些TP53突变体表现出功能获得（GOF）特性，通过失调促生存通路（如NF-κB、MAPK和PI3K/AKT）来驱动侵袭、转移和化疗耐药性[[6], [7], [8]]。

建立具有多种TP53突变的特征明确的HNSCC细胞系对于推进机制研究和治疗研究至关重要。源自患者的模型能够真实反映肿瘤的遗传复杂性，从而在体内模型系统中深入研究特定突变的表型，如侵袭性、药物反应和生长情况[9]。近期研究强调需要能够捕捉TP53突变谱系的模型，以识别基于情境的脆弱性并优化个性化治疗[10,11]。

在这项研究中，我们建立并表征了一组携带不同TP53突变的人口腔角质形成细胞（iHOK）永生化细胞系，其中包括高风险的C238F突变体。主要发现包括：

1. 1. 低风险和高风险mutp53细胞系在形态和生长方面存在异质性。
2. 2. 高风险TP53突变细胞系对顺铂具有较高的耐药性。
3. 3. 加权基因共表达网络分析（WGCNA）将mutp53亚型与应激反应和促转移通路联系起来。
4. C238F细胞系中p53相关功能获得机制富集。
这些发现突显了针对特定突变的模型在预测治疗结果和设计靶向策略方面的临床意义。
2D细胞培养
永生化的人正常口腔角质形成细胞NOM9-TK最初是从一名舌癌患者的组织学上正常的颊黏膜中通过短期培养获得的，这些细胞通过过表达pBabe-hTERT-puromycin和pBabe-CDK4-G418逆转录病毒质粒实现永生化[12]。NOM9-TK及其基因工程衍生物在37°C、5% CO₂环境中使用口腔角质形成细胞培养基（ScienCell, #2611）及口腔角质形成细胞生长补充剂进行培养。
mutp53细胞系的建立和生长特性分析
为了生成携带不同TP53突变的稳定细胞系，我们首先从一名舌癌患者的组织学上正常的颊黏膜中通过短期培养获得了永生化的人正常口腔角质形成细胞NOM9-TK[12]。NOM9-TK通过过表达pBabe-hTERT-puromycin和pBabe-CDK4-G418逆转录病毒质粒实现永生化，随后通过载体（pBabe-GFP）、wtp53或各种mutp53（A161S、R175H或C238F）质粒进行稳定转染。
讨论
患者来源的癌症模型的建立是转化肿瘤学的基石[25]。传统细胞系由于培养过程中的克隆选择，往往在遗传上无法完全模拟原发肿瘤，从而限制了它们在研究特定突变表型方面的应用[26]。最近开发的3D类器官和患者来源的异种移植物（PDXs）在病理生理相关性方面有所改进，但这些模型仍然资源密集且不适合高通量药物筛选[10]。
作者贡献声明
赵梅：撰写、审稿与编辑、项目监督、方法学设计、实验设计、数据管理。刘志毅：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学设计、数据分析。川边睦月：撰写、审稿与编辑、方法学设计、数据分析。阿卜杜拉·A·奥斯曼：资源支持。米切尔·J·弗雷德里克：撰写、审稿与编辑。杰弗里·N·迈尔斯：撰写、审稿与编辑、实验设计、资金筹措、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究结果的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了NIH资助，项目编号分别为600382 90 100300 52 00002673 1111和600382 90 100300 52 00013902 1111。