Elaeagnus rhamnoides L.) A. Nelson 植物化合物通过整合网络药理学、对接技术和分子模拟对免疫调节靶点产生的多靶点免疫调节作用

《Pharmacological Research - Modern Chinese Medicine》：Multi-Target Immunomodulatory Actions of Elaeagnus rhamnoides L.) A. Nelson Phytocompounds on Immune Regulatory Targets via Integrative Network Pharmacology, Docking, and Molecular Simulation

沙棘中活性成分通过分子对接、网络药理学及毒性评估，证实其对免疫检查点蛋白CTLA-4和LAG-3具有强结合力，其中narcissin、astragalin、tellimagradin I等成分结合能优于现有免疫抑制剂ipilimumab。DFT分析显示这些成分HOMO-LUMO能隙合理，平衡了反应活性与稳定性。ProTox-II毒性预测表明所有成分均低毒，尤其isoquercitrin安全性最佳。网络分析揭示其调控NF-κB、TLR4等核心通路，为开发多靶点免疫调节剂提供新方向。

　　
沙棘（*Elaeagnus rhamnoides*）作为传统中草药，其免疫调节潜力在近年研究中备受关注。本文通过整合网络药理学、分子对接、分子动力学模拟和毒性评估等多维度计算方法，系统解析了沙棘中6种关键活性成分（包括 narcissin、astragalin、tellimagradin I、isoquercitrin、procyanidin、strictinin）与免疫检查点蛋白（CTLA-4、LAG-3）的相互作用机制，并评估了其安全性和多靶点调节能力，为天然免疫调节剂的药物开发提供了理论依据。

### 一、研究背景与意义
沙棘在传统医学中已被用于增强免疫力、治疗慢性咳嗽及调节消化和心血管健康，但其作用机制长期存在争议。现代药理学研究表明，沙棘富含黄酮类、鞣质和酚酸等活性成分，可能通过调控炎症信号通路和免疫细胞功能发挥作用。然而，这些成分如何特异性地靶向免疫检查点蛋白（如CTLA-4和LAG-3）及其下游通路尚不明确。本研究首次通过计算生物学手段，系统评估了沙棘活性成分与免疫检查点蛋白的分子互作及多靶点调控网络，为天然免疫调节剂的机制解析和临床转化提供了新思路。

### 二、研究方法与技术路线
1. **网络药理学框架**
基于IMPPAT数据库筛选出29种沙棘活性成分，结合SuperPred预测其与免疫相关靶点的结合概率（阈值>80%）。通过STRING数据库构建基因-疾病关联网络，筛选出与免疫失调密切相关的10个核心靶点（如NF-κB1、HIF1A、MAOA等），最终确定CTLA-4和LAG-3为关键检查点蛋白进行深度分析。

2. **分子对接与稳定性验证**
- 采用Glide XP模式对CTLA-4（PDB:1AH1）和LAG-3（PDB:7TZG）进行网格划分与化合物对接，计算结合能（ΔGbind）和氢键网络。
- 通过分子动力学（MD）模拟评估复合物稳定性：选择 Astragalin-CTLA-4和Tellimagradin I-LAG-3复合物进行100纳秒的动态模拟，分析RMSD（根均方偏差）、RMSF（残基均方根 fluctuation）及Rg（回转半径）等参数，验证结合口袋的构象刚性。
- 采用MM-GBSA计算结合自由能，分解为范德华力（ΔGbind vdW）、静电作用（ΔGbind Coulomb）、氢键（ΔGbind Hbond）等贡献项，量化不同作用力的主导地位。

3. **电子性质与毒性评估**
- 基于DFT计算分析HOMO-LUMO能隙（3.76-4.82 eV），评估化合物化学稳定性和反应活性：能隙越低（如Strictinin 3.76 eV），分子越易参与氧化还原反应；能隙较高（如Astragalin 4.82 eV）则体现更好的代谢稳定性。
- 利用ProTox-II工具预测6种化合物的器官毒性（肝、肾、神经等）和系统毒性（致癌性、致突变性），结果显示所有化合物神经毒性概率均<0.87，且Isquercitrin在安全性评分（0.69-0.91）上表现最优。

### 三、核心研究发现
1. **免疫检查点蛋白的靶向结合**
- **CTLA-4结合**：Narcissin（-5.28 kcal/mol）和Tellimagradin I（-4.25 kcal/mol）展现出最优结合亲和力，均通过ASP88、ARG38等关键残基形成多价氢键网络。例如，Narcissin与ASP88形成双氢键（1.66 ?和2.00 ?），同时与ARG38（盐桥）、GLN39（1.77 ?）等残基协同作用，总结合能低于标准抗体Ipilimumab（-2.15 kcal/mol）。
- **LAG-3结合**：Astragalin（-7.43 kcal/mol）和Procyanidin（-6.55 kcal/mol）表现出显著结合优势，前者通过ARG58（1.86 ?）、ASP131（1.77 ?）等残基形成5个氢键，后者则与ARG129形成双氢键（2.07 ?和2.35 ?）及盐桥（ARG57）。

2. **动态稳定性与作用机制**
- MD模拟显示，Astragalin-CTLA-4复合物在100纳秒内RMSD稳定于4.5-5.5 ?，表明蛋白-配体界面刚性较强。而Tellimagradin I-LAG-3复合物中，RMSF显示关键结合残基（如ARG129、ASP52）的局部柔性（波动范围0.5-2.5 ?），可能增强配体对动态结合口袋的适应性。
- MM-GBSA分析表明，Astragalin与LAG-3的结合中，疏水作用（-53.96 kcal/mol）占比达79.5%，其次是范德华力（-21.10 kcal/mol），氢键贡献仅0.6 kcal/mol，提示其作用以疏水互补为主。

3. **多靶点调控网络**
网络药理学分析揭示，6种化合物通过调控10个核心免疫基因（NF-κB1、MAOA、HIF1A、TLR4等）形成多靶点网络：
- **Narcissin**：主导调控HIF1A（缺氧诱导因子）和MAOA（单胺氧化酶），可能通过抑制NF-κB信号和抗氧化通路（Nrf2/HO-1）实现免疫平衡。
- **Astragalin**：通过抑制TLR4/NF-κB通路（靶向CDK1、CTSD）和调节MAOA活性，在过敏和结肠炎模型中已显示协同抗炎作用。
- **Tellimagradin I**：在LAG-3结合 pocket中形成7个氢键（包括ARG129双氢键），其结构特征（ HHDP-Galloyl糖苷键）可能增强对T细胞耗竭微环境的调控。

### 四、安全性评价与优化方向
1. **低毒性与代谢优势**
所有化合物均通过ProTox-II的神经毒性筛查（概率<0.87），其中Isquercitrin在肝、肾毒性（概率>0.85）和致癌性（0.85）评分最优，提示其作为长期用药的潜力。
- **电子特性**：DFT分析显示，Astragalin能隙最高（4.82 eV），表明其代谢稳定性优于其他化合物，适合开发慢性免疫调节剂。
- **毒性机制**：Narcissin因含糖苷基团可能引起轻微肝酶升高（ProTox-II预测值0.81），而Procyanidin的酚酸结构需注意高剂量下的黏膜刺激性。

2. **优化策略**
- **结构修饰**：针对Narcissin的糖苷基团，可开发无糖衍生物以降低肝脏负担；对Tellimagradin I的HHDP结构进行空间位阻优化，可能增强对LAG-3的特异性结合。
- **多靶点协同**：Astragalin与 Procyanidin的协同作用可覆盖NF-κB和TLR4双通路，减少单一靶点抑制的副作用风险。

### 五、与传统医学理论的衔接
研究发现的免疫调控机制与传统药典描述高度一致：
- **“益气养阴”理论**：Astragalin通过抑制NF-κB（炎症信号枢纽）和促进Th1/Th2平衡（实验模型中降低IL-4/IFN-γ比值），与中医“调节气机”概念契合。
- **“解毒散结”实践**：Tellimagradin I对MRSA的协同抗菌作用（与β-内酰胺类联用降低MIC值），印证了其“解毒”特性在感染与肿瘤免疫治疗中的应用潜力。
- **“调和阴阳”的现代诠释**： compounds通过同时抑制（如CTLA-4介导的过度免疫）和激活（如TLR4介导的先天性免疫），实现免疫系统的动态平衡。

### 六、结论与展望
本研究证实沙棘活性成分具有显著的免疫检查点调控能力：
1. **机制创新性**：首次揭示Narcissin通过双氢键竞争性抑制CTLA-4/B7共刺激信号，而Tellimagradin I通过七重氢键锁定LAG-3的MHC-II结合界面。
2. **临床转化价值**：Astragalin在慢性炎症（如结肠炎）和肿瘤免疫治疗（如通过抑制LAG-3逆转T细胞耗竭）中展现多靶点优势，其代谢稳定性（高HOMO-LUMO能隙）降低药物代谢衰减风险。
3. **毒性控制**：Isquercitrin的“全绿”毒性评分（肝、肾、神经毒性均<0.75）提示其作为基础免疫调节剂的可行性。

未来研究需重点验证：
- **体外验证**：通过类器官或免疫细胞共培养系统，量化化合物对CTLA-4/LAG-3介导的T细胞抑制/激活效应。
- **体内模型**：在肿瘤微环境（PDX模型）或自身免疫疾病（如类风湿性关节炎）中评估多靶点协同效应。
- **代谢动力学**：结合DFT预测的电子特性（如Narcissin的HOMO-LUMO能隙4.12 eV），优化给药途径（如纳米载体递送以提高肠道吸收率）。

### 七、对天然药物研究的启示
1. **多靶点整合**：天然化合物通过调控免疫检查点（CTLA-4/LAG-3）和核心通路（NF-κB/TLR4）实现协同作用，为复方开发提供理论支持。
2. **计算预测的转化路径**：网络药理学筛选靶点（如HIF1A在缺氧性炎症中的枢纽作用）与分子对接结合，可高效定位天然产物的活性基团。
3. **毒性-活性平衡**：通过DFT筛选低毒性高活性化合物（如Isquercitrin的4.02 eV能隙与0.69综合毒性评分），可加速“绿色药物”开发。

该研究为沙棘从传统药材向精准免疫调节剂转化提供了系统性解决方案，其计算生物学方法（如MM-GBSA能量分解）可推广至其他植物活性成分的机制解析。