新型内源性微肽XLH-36通过结合Gemin4促进三阴性乳腺癌转移的机制研究

《Oncogene》：The novel endogenous micropeptide XLH-36 binds Gemin4 to promote triple-negative breast cancer metastasis

本研究针对三阴性乳腺癌(TNBC)转移机制不明的临床难题，发现由长链非编码RNA C5orf66-AS1编码的新型微肽XLH-36可作为"致癌驱动因子"。通过多组学分析证实XLH-36在TNBC中显著高表达且与不良预后相关，机制研究表明XLH-36通过直接结合Gemin4蛋白，阻碍其入核行使剪接功能，导致S100A4表达下调而ICAM1代偿性升高，最终促进上皮间质转化(EMT)和肿瘤转移。该研究为TNBC提供了新的诊断生物标志物和治疗靶点。

　　

在全球范围内，乳腺癌始终是女性健康的首要威胁，而三阴性乳腺癌(TNBC)作为最具侵袭性的亚型，因其缺乏雌激素受体、孕激素受体和HER2表达，治疗选择极为有限。更严峻的是，TNBC患者五年总生存率在发生转移后将从77%骤降至12%，这种断崖式的生存率落差凸显了揭示其转移机制的紧迫性。尽管EGFR、VEGF等生物标志物的研究取得了一定进展，但临床疗效仍未获得实质性突破。近年来，科学家们发现那些隐藏在非编码区域的微小开放阅读框(sORF)实际上能够编码具有生物活性的微肽，这些微肽在不同肿瘤中扮演着原癌基因或抑癌基因的角色，为肿瘤研究开辟了新视角。

正是在这样的背景下，中国药科大学徐汉梅教授团队在《Oncogene》杂志上发表了一项突破性研究。研究人员利用团队建立的整合核糖体测序(Ribo-seq)、质谱分析和机器学习技术的微肽发现平台，从1295例乳腺癌患者样本中筛选出一个新的候选分子——由长链非编码RNA C5orf66-AS1编码的36个氨基酸微肽XLH-36。

研究团队首先通过生物信息学分析发现，C5orf66-AS1在乳腺癌尤其是TNBC组织和细胞系中显著高表达。更为重要的是，TNBC患者中C5orf66-AS1高表达组的总体生存率较低表达组降低20%，且XLH-36表达水平与乳腺癌临床分期呈正相关。为了确认XLH-36确实是一个功能性的微肽，研究人员通过基因编辑技术在其C端引入Flag标签，并通过免疫印迹和免疫荧光验证了其内源性表达。跨101个物种的保守性分析显示，XLH-36在灵长类动物中高度保守，暗示其可能具有重要的生物学功能。

在功能研究方面，研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了XLH-36敲除的TNBC细胞系，发现敲除XLH-36显著抑制了细胞增殖、迁移和侵袭能力，而过表达XLH-36则促进这些恶性表型。动物实验进一步证实，XLH-36敲除可抑制移植瘤的生长和肺转移，而过表达则产生相反效果。为了区分是XLH-36微肽本身还是其宿主RNA发挥作用，研究团队设计了精妙的对照实验：构建了起始密码子ATG突变的载体(XLH-36-OE-ATG-Mut)和仅改变核苷酸序列但不改变氨基酸序列的载体(XLH-36-OE-SNS)。结果明确显示，只有能够翻译产生XLH-36的载体才能恢复XLH-36敲除细胞的恶性表型，证明XLH-36微肽而非C5orf66-AS1 RNA是真正的功能执行者。

机制探索方面，亚细胞定位分析表明XLH-36主要定位于内质网。通过免疫共沉淀联合质谱分析，研究人员筛选出140个可能与XLH-36相互作用的蛋白，其中Gemin4得分最高。随后的酵母双杂交、分子对接和微尺度热泳动(MST)分析证实了XLH-36与Gemin4之间的直接相互作用，并鉴定出XLH-36的P16位点是关键结合位点，其结合常数K_d值为4.76×10^-6，表明两者具有强亲和力。

Gemin4是运动神经元存活(SMN)复合体的重要组成部分，该复合体主要负责小核核糖核蛋白(snRNP)的组装和pre-mRNA剪接。有趣的是，与预期相反，本研究显示Gemin4在乳腺癌组织中低表达，且高表达Gemin4的患者预后更好，功能实验证明Gemin4可抑制TNBC细胞增殖和迁移，表明其发挥抑癌基因作用。进一步机制研究表明，XLH-36通过与Gemin4结合，将其"扣押"在胞质中，阻止其进入细胞核促进S100A4 mRNA的剪接，从而降低S100A4的表达水平。

RNA-seq分析揭示了XLH-36调控的下游通路：XLH-36敲除导致640个基因差异表达，这些基因富集于细胞外基质受体相互作用、黏着斑和细胞黏附分子等与细胞迁移侵袭相关的通路。其中，ICAM1和S100A4的表达变化最为显著。深入研究发现了有趣的调控关系：S100A4下调会导致ICAM1代偿性上调，进而激活上皮间质转化(EMT)进程。实验证明，S100A4 knockdown可逆转XLH-36敲除对细胞恶性表型的抑制作用，而ICAM1 knockdown则可抵消XLH-36过表达的促进作用。

最后，研究人员通过α-鹅膏蕈碱转录抑制实验和放线菌酮蛋白合成抑制实验证实，Gemin4确实通过影响S100A4 mRNA的稳定性来调控其表达。免疫荧光实验直观展示了XLH-36对Gemin4亚细胞定位的影响：XLH-36敲除增加Gemin4的核定位，而过表达则使其滞留于胞质。同时，EMT标志物TWIST1和SNAI1的表达变化也验证了XLH-36/Gemin4/S100A4/ICAM1轴对EMT进程的调控作用。

本研究的关键技术方法包括：利用TCGA和GEO数据库的临床样本RNA-seq数据进行分析；通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建XLH-36敲除和敲入细胞系；采用免疫共沉淀-质谱联用技术筛选相互作用蛋白；运用酵母双杂交、分子对接和微尺度热泳动技术验证蛋白-肽相互作用；通过体内外功能实验（CCK-8、Transwell、动物模型等）评估XLH-36的生物学功能；利用RNA-seq和生物信息学分析筛选下游靶基因。

研究结果表明，XLH-36是一个新的致癌微肽，在TNBC中高表达且与不良预后相关。它通过直接结合Gemin4，改变其亚细胞定位，进而影响S100A4 mRNA的剪接和稳定性，导致ICAM1代偿性上调，最终促进EMT和肿瘤转移。

讨论部分强调，本研究不仅发现了一个新的TNBC预后生物标志物和潜在治疗靶点，还首次揭示了Gemin4在TNBC中的抑癌作用，以及XLH-36/Gemin4/S100A4/ICAM1这一全新的调控轴。该研究为理解非编码RNA编码产物的功能提供了新范例，为TNBC的精准治疗开辟了新途径。未来研究可进一步探索靶向XLH-36的治疗策略，以及其在液体活检中的应用价值。