基于环境DNA的野生褐鳟种群线粒体谱系多样性高效评估新方法

《Scientific Reports》：Efficient eDNA-based assessment of mitochondrial lineage diversity in wild brown trout populations

本研究针对传统遗传监测方法侵入性强、成本高的问题，开发了基于环境DNA（eDNA）的褐鳟（Salmo trutta complex）线粒体控制区（CR）谱系多样性评估方案。通过对10个意大利中部水域的验证，发现eDNA与组织样本分析的谱系频率高度相关（Pearson r=0.93），且谱系组成高度一致（Mantel r=0.834）。该方法为褐鳟种群遗传监测提供了高效非侵入性工具，尤其适用于外来谱系识别与保护遗传学应用。

　　

在淡水生态系统中，褐鳟（Salmo trutta complex）作为一种具有重要生态和经济价值的物种，其种群遗传多样性的监测对于保护生物学和渔业管理至关重要。传统的遗传监测方法通常需要捕获鱼类并采集组织样本，这种方法不仅对鱼类造成伤害，而且成本高、效率低，难以在大范围或敏感区域实施。随着环境DNA（environmental DNA, eDNA）技术的兴起，科学家们开始探索利用水体中脱落的DNA片段来监测物种存在和群落组成。然而，利用eDNA技术评估种内遗传多样性，特别是线粒体谱系多样性，仍然是一个相对未被充分探索的领域。褐鳟的线粒体控制区（Control Region, CR）存在多个进化谱系，如亚得里亚海（AD）、大西洋（AT）、大理石（MA）和地中海（ME）谱系等，这些谱系的组成可以有效反映种群的遗传背景和保护状态，尤其是识别外来放养个体（通常属于AT谱系）。因此，开发一种基于eDNA的非侵入性方法，用于快速、准确地评估野生褐鳟种群的线粒体谱系多样性，具有重要的科学和应用价值。

本研究旨在开发并验证一种基于eDNA的高效方法，用于评估野生褐鳟种群的线粒体谱系多样性。研究人员选择意大利中部10个具有不同环境特征（如海拔、水温、水流）且已知褐鳟谱系组成的水域作为研究地点。研究流程主要包括：eDNA样本采集（使用真空泵过滤4升河水）、定制引物扩增线粒体CR片段（192 bp）、新一代扩增子测序（DNBSEQ-G400平台）、生物信息学处理（QIIME2, DADA2）以及基于自定义参考数据库的谱系鉴定。同时，研究还通过传统的电渔法采集鱼类组织样本进行Sanger测序，以获得谱系组成的参考数据，并比较两种方法的结果。关键方法还包括利用广义线性混合模型（GLMM）和广义加性混合模型（GAMM）等统计模型评估eDNA与组织样本谱系频率的一致性，并分析环境因子（如水温、鱼类密度）对一致性的影响。

主要研究结果

eDNA测序与谱系鉴定

生物信息学分析平均每个重复获得223,619条测序读数，其中94.4%成功比对到自定义的CR参考数据库。共鉴定出12个单倍型，分属5个线粒体谱系（AD, AT, MA, ME, DA）。谱系间遗传分化最大的是AT与MA（平均5.33个碱基置换），最小的是MA与ME（平均1.67个碱基置换）。阴性对照（野外空白、提取空白、PCR空白）均未检测到读数，表明污染控制有效。

eDNA读数与鱼类丰度的关系

eDNA测序获得的读数数量与通过电渔法估算的褐鳟丰度（SC₂₀₂₄：单位面积生物量；DI₂₀₂₄：单位面积个体数）之间未发现显著的秩相关关系（Spearman检验p > 0.05）。这表明在本研究涉及的生态异质性较强的水域中，eDNA读数计数不能作为鱼类绝对丰度的可靠指标，可能受eDNA脱落率、水温、水流等多种因素影响。

eDNA与组织样本谱系频率的一致性

eDNA估算的谱系频率（F_eDNA）与组织样本估算的频率（F_tissue）呈极显著正相关（Pearson r = 0.93, p < 0.0001）。基于谱系组成计算的地点间欧氏距离矩阵也高度相关（Mantel检验 r = 0.834, p = 0.0001）。非度量多维标度（NMDS）分析显示，基于两种方法得到的谱系组成在排序图上位置接近，且置换多元方差分析（PERMANOVA）表明组间无显著差异（p = 0.940）。这些结果均表明eDNA能可靠地反映种群的（半定量）谱系结构。

谱系频率估计的差异分析

标准化差异度量（d）的分析表明，eDNA作为谱系频率的估计量在统计上并非“完美”。然而，较大的差异（|d| > 3 SD）主要出现在组织样本中未检测到（F_tissue = 0）的谱系上。例如，在MOL地点，eDNA检测到约17%的ME谱系，而组织样本中未发现。这可能是eDNA检测稀有谱系能力更强（因其采样范围可能更广），也可能是假阳性或近年来的种群遗传组成变化所致。绝对标准化差异（|d|）与组织样本频率（F_tissue）无关，但与褐鳟密度指数（DI₂₀₂₄）呈边际显著的负相关（GAMM: F=3.781, p=0.060），即鱼类密度越高，一致性越好。同时，地点内欧氏距离（衡量两种方法谱系组成差异）与水温呈正相关（Spearman r=0.723, p=0.018），表明水温升高可能通过加速eDNA降解而降低评估准确性。

讨论与结论

本研究成功开发并验证了一种基于eDNA和扩增子测序的非侵入性方法，用于评估野生褐鳟种群的线粒体谱系多样性。结果表明，eDNA能够高度还原种群的谱系组成，与耗时耗力的传统方法结果高度一致。该方法在检测稀有谱系方面可能更具潜力，但也需谨慎对待可能的假阳性。环境因素如鱼类密度和水温会影响评估的准确性。

这项研究的成功为褐鳟乃至其他水生物种的遗传监测提供了强有力的新工具。它特别适用于大规模筛查、保护状况评估（如识别外来AT谱系）、以及难以进行传统采样的区域。尽管该方法会因使用短片段和保守的谱系划分而低估线粒体多样性，但这对于以保护遗传学为导向的初步快速评估而言是可接受的折衷。此外，定制引物的交叉扩增测试表明其有潜力应用于其他鲑科鱼类（如虹鳟Oncorhynchus mykiss、大西洋鲑Salmo salar），为未来同时监测多种鲑科鱼的种内遗传多样性奠定了基础。未来的研究可在受控或半自然条件下进一步验证该方法的稳健性和适用性。总之，这项发表在《Scientific Reports》上的工作显著推进了eDNA在种内遗传多样性评估领域的应用，为水生生物多样性保护和管理的非侵入性遗传监测开辟了新途径。