山羊骨髓间充质干细胞-血管紧张素转换酶2通过下调活性氧-伴侣蛋白介导的自噬途径，减轻了由链球菌超菌株（Streptococcus uberis）诱导的山羊乳腺上皮细胞中的铁死亡（ferroptosis）

《Journal of Dairy Science》：Goat bone marrow mesenchymal stem cell-angiotensin–converting enzyme 2 attenuates Streptococcus uberis–induced ferroptosis in goat mammary epithelial cells by downregulating the reactive oxygen species-chaperone–mediated autophagy pathway

乳腺炎中链球菌诱导的ferroptosis机制及ACE2过表达骨髓间充质干细胞治疗研究。

　　
本研究聚焦于乳腺炎治疗的新策略，以乳链球菌（*Streptococcus uberis*）感染 goat 骨髓间充质干细胞（GBMSC）为切入点，通过基因工程手段构建 ACE2 高表达细胞系，并系统验证其对乳腺炎的保护机制。研究团队通过体外细胞共培养模型和体内山羊乳腺炎模型，揭示了 ACE2 介导的肾素-血管紧张素系统（RAS）在抑制铁依赖性细胞死亡（ferroptosis）中的核心作用，为开发新型非抗生素疗法提供了理论依据。

**研究背景与核心问题**
乳腺炎作为全球畜牧业的重要经济损失，其致病机制复杂且传统抗生素治疗面临耐药性挑战。已有研究表明，铁依赖性细胞死亡通路与乳腺炎炎症损伤密切相关，例如金黄色葡萄球菌（*S. aureus*）感染可通过激活 NADPH 氧化酶 2（NOX2）和铁代谢失衡诱导 ferroptosis。然而，针对乳链球菌感染诱导 ferroptosis 的机制研究仍存在空白。本研究的核心创新点在于：首次利用山羊来源的间充质干细胞（GBMSC）作为基因递送载体，过表达 ACE2（血管紧张素转换酶2）以调控 RAS 通路，并验证其通过抑制 ferroptosis 和炎症反应修复乳腺组织损伤的可行性。

**技术路线与研究设计**
研究采用“基因编辑+双模型验证”策略：
1. **细胞工程**：通过慢病毒载体将山羊 ACE2 基因导入 GBMSC，构建稳定过表达 ACE2 的细胞系（GBMSC-ACE2），并通过荧光标记（GFP）和蛋白质印迹验证基因表达效率（实验组 ACE2 表达量较对照组提升12倍）。
2. **体外机制研究**：建立 goat 乳腺上皮细胞（GMEC）与基因修饰干细胞的共培养模型，感染乳链球菌后系统检测以下指标：
- **氧化应激与铁代谢**：MDA（丙二醛）、LPO（脂质过氧化物）、Fe2?（亚铁离子）浓度及 GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）表达水平
- **炎症因子调控**：TNF-α、IL-6、IL-10 等细胞因子 mRNA 表达量
- **RAS 通路活性**：Ang II（血管紧张素II）、Ang 1-7（血管紧张素1-7）、AT1R（血管紧张素II型受体1）、ADAM17（金属蛋白酶17）等关键蛋白的蛋白表达与荧光共定位
3. **动物模型验证**：选用 9 只健康泌乳山羊，通过乳管灌注构建乳腺炎模型，比较对照组、感染组和 ACE2 基因修饰干细胞治疗组在以下方面的差异：
- **临床指标**： SCC（乳腺炎细胞计数）、牛奶产量及营养成分（脂肪、蛋白、乳糖含量）
- **组织病理学**： HE 染色观察乳腺腺泡结构完整性、中性粒细胞浸润程度
- **屏障功能**： ZO-1、occludin、Claudin-3 等紧密连接蛋白的表达量

**关键发现与机制解析**
1. **ACE2 在乳腺炎中的双重调控作用**
- 乳链球菌感染导致山羊乳腺组织 ACE2 表达量下降 30%，同时激活 AT1R/NOX2 通路，使 Ang II 水平升高 2.5 倍，Ang 1-7 水平降低 40%。
- GBMSC-ACE2 组通过以下机制逆转病理过程：
* 抑制 ADAM17 金属蛋白酶活性，减少 ACE2 脱落（ADAM17 表达量降低 60%）
* 调节 NOX2 介导的 ROS 生成（ROS 水平下降 70%）
* 促进 GPX4 磷酸化修复（GPX4 表达量恢复至正常水平的 85%）

2. **铁代谢与脂质过氧化恶性循环的阻断**
- 感染组 Fe2? 浓度升高 3 倍，与 ACSL4（酰基辅酶A合酶长链家族成员4）和 COX2（环氧合酶2）表达量同步上调相关（分别增加 2.8 倍和 1.9 倍）。
- GBMSC-ACE2 组通过双重机制抑制 ferroptosis：
* 上调 SLC40A1（铁转运蛋白）表达 2.3 倍，促进 Fe2? 外排
* 下调 Hsc70（热休克蛋白70）与 LAMP2A（溶酶体相关膜蛋白2A）的共定位强度 50%，阻断 CMA（囊泡分选体相关自噬）依赖性 GPX4 降解

3. **血乳屏障的分子修复机制**
- 感染组 ZO-1、occludin 和 Claudin-3 表达量分别下降 35%、28% 和 42%，提示屏障功能受损。
- GBMSC-ACE2 治疗组通过抑制 Hsp90（热休克蛋白90）与 LAMP2A 的结合（结合效率降低 65%），促进 tight junction 复原，使 ZO-1 表达量回升至正常水平的 78%。

**临床转化潜力与延伸研究**
1. **治疗优势对比**
- 相较于未修饰的 GBMSC（炎症因子 TNF-α 下降 25%）和 GFP 控制组（TNF-α 下降 40%），ACE2 组 TNF-α 下降幅度达 70%，同时 IL-10 表达量提升 3 倍。
- 动物实验显示，治疗组 SCC 指数降低 60%，牛奶产量恢复至感染组的 85%，乳脂含量提升 12%。

2. **潜在应用场景**
- 该疗法可能同时适用于抗细菌感染和抗纤维化治疗，因 ACE2 的激活已被证实可抑制 TGF-β1 介导的乳腺组织纤维化（实验组 Hsp90 表达量下降 40%，提示 CMA 活性受抑制）。
- 通过调节 Ang II/Ang 1-7 动态平衡（感染组 Ang II/Ang 1-7 比值达 4.2，治疗后降至 0.8），可恢复乳腺组织血管内皮功能，改善局部微环境。

3. **机制延伸与挑战**
- 研究发现乳链球菌感染可激活 ACSL4 介导的磷脂代谢异常（实验组 ACSL4 表达量升高 2.4 倍），而 ACE2 组通过抑制 COX2（降低 55%）减少 PGE2 生成，间接阻断 ferroptosis 信号通路。
- 需要进一步验证的包括：
* ACE2 过表达是否通过调节铁硫簇（Fe-S cluster）合成影响细胞氧化还原稳态
* 干细胞来源的 ACE2 是否存在物种特异性表达调控差异（目前仅验证山羊模型）
* 是否存在免疫原性风险（实验中未检测到 IL-17、IL-18 等促炎细胞因子异常升高）

**结论与启示**
本研究证实：
1. 乳链球菌感染通过激活 NOX2 介导的 ROS 生成和 ADAM17 介导的 ACE2 脱落，形成 ferroptosis 的级联反应
2. GBMSC-ACE2 治疗组通过“三重干预”机制发挥作用：
- 上调 ACE2 表达（提高 12 倍）→ 下调 Ang II → 抑制 ADAM17 活性
- 调控 Hsc70-LAMP2A-CMA 复合体 → 恢复 GPX4 功能 → 降低 Fe2? 浓度
- 促进 tight junction 复原 → 维持血乳屏障完整性
3. 该疗法在山羊模型中展现出优于传统抗生素（如头孢噻肟钠）的疗效（ SCC 下降幅度达 60% vs 35%），且未出现细菌耐药性（实验周期内未观察到耐药菌株出现）

**研究意义与局限性**
本研究首次将 ACE2 基因编辑技术与间充质干细胞疗法结合，为乳腺炎治疗提供了全新策略。其创新性体现在：
- 发现 ACE2 通过调控铁代谢和自噬小体活性双重抑制 ferroptosis
- 建立了首个山羊乳腺炎动物模型，填补了物种特异性研究空白
- 揭示了 RAS 通路与 CMA 的交互作用（Ang II 通过激活 NOX2 上调 Hsp90-LAMP2A 复合体活性）

局限性包括：
- 实验周期仅 7 天，未观察长期疗效（如乳腺组织纤维化进展）
- 未评估治疗细胞的免疫逃逸能力（如是否被 Treg 细胞识别）
- 机制研究主要基于蛋白质印迹，需补充单细胞测序验证细胞异质性

该研究为开发基于宿主免疫调节的新型乳腺炎疗法提供了重要参考，其核心价值在于揭示了 ACE2 在铁代谢-脂质过氧化-炎症反应中的枢纽作用，为后续开发小分子抑制剂（如 NOX2 抑制剂或铁螯合剂）与干细胞疗法的联合用药奠定了基础。