基于多组学技术的酿酒酵母工程改造，以调控高级醇和丙酮醇的生物合成，从而提升葡萄酒的感官复杂度

《LWT》：Multi-Omics-Guided Engineering of Saccharomyces cerevisiae to Modulate Higher Alcohols and Acetoin Biosynthesis for Improved Wine Sensory Complexity

通过多组学分析和代谢工程，成功重构酿酒酵母代谢通路，显著提升乙偶姻产量达4.33倍，同时将异丁醇等高醇含量降低58.7%，为优化葡萄酒风味提供新策略。

　　
该研究聚焦于利用代谢工程优化酿酒酵母（*S. cerevisiae*）的发酵性能，旨在同步提升风味物质acetoin（3-羟基-2-丁酮）的合成量并显著降低可能引起负面感官效应的高浓度醇（如异丁醇、活性戊醇等）。研究通过整合转录组与代谢组多组学分析，系统解析了氮源浓度对酵母代谢通路的调控机制，并基于此构建了8株重组工程菌株，最终筛选出具有最佳性能的BY07菌株。

### 研究背景与意义
在葡萄酒工业中，高酒精浓度与不良风味物质的平衡始终是技术难点。传统发酵工艺依赖自然筛选和适应性育种，周期长且难以精准调控代谢路径。近年代谢工程技术的突破，使得定向改造微生物代谢网络成为可能。acetoin作为重要的风味增强物质，具有坚果和奶油香调，但酵母中其天然产量较低，且其合成与高浓度醇的代谢存在竞争关系。研究团队通过多维度组学分析，首次系统揭示了无机氮源浓度对酵母高浓度醇与acetoin代谢的双重调控机制，并成功开发出具有工业化应用潜力的工程菌株。

### 关键发现
1. **氮源浓度梯度对代谢的调控作用**
实验发现，当NH4Cl浓度从200 mg/L提升至350 mg/L时，异丁醇和活性戊醇等高浓度醇总量下降17.8%，而acetoin产量提升7.6%。进一步将氮源浓度增至500 mg/L时，acetoin产量达到峰值（1.13 g/L），同时高浓度醇总量下降至170.83 mg/L，较野生型降低11.9%。这一非线性响应表明，氮源浓度通过激活特定代谢通路的交叉调控网络，实现对风味物质合成的精准控制。

2. **代谢通路的系统性重构**
转录组分析揭示了氮浓度梯度下酵母代谢网络的重组机制：
- **氨基酸代谢通路**：关键氮代谢酶基因（如GDH1、GLN1）在氮源浓度≥350 mg/L时显著上调，促进谷氨酸合成并抑制支链氨基酸向高浓度醇的转化。
- **碳代谢重编程**：在500 mg/L氮源条件下，糖酵解关键酶（如PGM2、HXK1）表达量提升2-3倍，推动更多碳 flux 进入acetoin合成途径。
- **乙醛代谢调控**：通过敲除BDH1（抑制2,3-丁二醇氧化）和ADH5（阻断乙醛还原生成高浓度醇），将acetoin半衰期延长至72小时，较野生型提升4.33倍。

3. **工程菌株的定向优化**
通过组合基因编辑策略（敲除/过表达共12个关键基因），筛选出BY07菌株：
- **代谢网络优化**：敲除BDH1（抑制2,3-丁二醇生成）、ADH5（阻断乙醛还原），同时过表达BAT2（促进支链氨基酸脱羧）、BDH2（加速乙酰乳酸还原为acetoin），形成代谢途径的协同调控。
- **性能突破**：在发酵终点（72小时），BY07菌株实现：
- acetoin产量达1.05 g/L（野生型0.20 g/L），提升4.33倍
- 总高浓度醇产量降低58.7%（野生型189.06 mg/L→178.34 mg/L）
- 异丁醇浓度下降58.7%（从15.39→6.34 mg/L）
- 2-苯乙醇产量提升46.3%（从36.21→52.77 mg/L），改善酒体平衡性

4. **调控机制创新性解析**
- **氮代谢-碳代谢耦合机制**：高浓度NH4Cl通过激活谷氨酸合成（GDH1/GLN1通路），间接抑制丙酮酸羧化酶活性，减少乙酰辅酶A向高浓度醇的分流。
- **NADH/NAD+动态平衡**：代谢组学数据显示，500 mg/L氮源条件下细胞内NADH+比例下降32%，促进糖酵解向脂质/氨基酸合成偏移，为acetoin积累创造氧化还原环境。
- **ABC转运蛋白介导的代谢物跨膜调控**：通过质谱检测发现，高浓度氮源显著上调HXT2（葡萄糖转运蛋白）和ABC转运蛋白基因（如PDR12），形成对acetoin前体物的选择性摄取机制。

### 技术突破与工业化应用前景
1. **多组学协同分析范式**
首次将转录组（筛选735个差异基因）、代谢组（鉴定897种差异代谢物）与代谢通量分析结合，构建了“基因-代谢物-通路”三维调控模型。例如，通过追踪leucine（亮氨酸）和isoleucine（异亮氨酸）的代谢流变化，发现其向2-苯乙醇的分流比例与acetoin产量呈负相关（r=-0.87）。

2. **工程菌株的产业化适配性**
- **发酵动力学优化**：BY07菌株在28℃厌氧发酵中，72小时完成糖耗率（200 g/L→0）和乙酸生成量（5.8→9.2 g/L）的平衡调控，确保酒体酸度（总酸12.3 g/L）符合商业标准。
- **代谢稳态维持**：通过过表达BDH2（14.29倍）和 AlsD（来自枯草芽孢杆菌），将乙酰乳酸→acetoin的转化率提升至92%，而野生型仅为68%。
- **安全阈值控制**：所有工程菌株的高浓度醇总和均低于400 mg/L（安全阈值下限），且未出现异常代谢副产物（如乙醛、乙酸浓度均处于正常范围）。

3. **规模化生产的潜在瓶颈**
研究发现，工程菌株BY08因过度表达ALD6（醛脱氢酶6）导致乙酸积累（达9.8 g/L），引发细胞应激反应（HSP70表达量升高3倍），这提示在代谢工程中需建立多目标优化模型，避免单一通路改造引发连锁反应。

### 理论贡献与学科价值
1. **揭示氮代谢的跨尺度调控机制**
揭示了无机氮源通过三重途径调控风味代谢：
- **直接代谢调控**：激活GDH1/2促进谷氨酸合成（占氮代谢流38%）
- **能量平衡调控**：上调HXK1（糖酵解激活剂）和PDC5（丙酮酸羧化酶），将糖代谢分流比从42%提升至67%
- **氧化还原调控**：通过调控ALD6和BDH2的活性，使NADH/NAD+比例稳定在1.2:1（野生型为0.8:1）

2. **建立代谢工程新方法论**
提出“三步定向改造法”：
- **通量预测**：基于13C标记代谢组学数据构建GAP模型（预测误差<15%）
- **靶点筛选**：通过QBS（质量谱生物信息学）系统鉴定出BDH1、ADH5、BAT1等7个关键调控节点
- **多目标优化**：采用混合整数规划模型，在保证酵母生长（OD600达2.8）前提下，将acetoin产量提升4倍，高浓度醇总和降低58.7%

3. **拓展合成生物学应用场景**
研究中开发的CRISPR-Cas9多靶点编辑技术（单次操作敲除3个基因/过表达2个基因），可将重组效率从常规的12%提升至79%，为工业菌株改造提供高效工具。

### 工业化实施建议
1. **菌株工程方案**
推荐采用BY07的基因组合策略（BDH1Δ/ADH5Δ/BAT2过表达），配合氮源梯度控制（200-500 mg/L NH4Cl分阶段添加），可同步实现：
- acetoin产量提升4.33倍
- 异丁醇/活性戊醇总和降低58.7%
- 酒体pH稳定在3.4-3.6区间

2. **发酵工艺优化**
- **前发酵阶段**（0-48h）：维持200 mg/L NH4Cl，促进葡萄糖高效转化为乙醇（乙醇产量达50 g/L）
- **后发酵阶段**（48-72h）：梯度添加至500 mg/L NH4Cl，激活氮代谢补偿机制，将acetoin合成速率从0.8 g/L·h提升至1.2 g/L·h
- **氧调控策略**：通过DO控制在0.8-1.2区间，使醋酸生成量减少23%，同时促进乙醛酸循环（TCA）向acetoin合成方向转化

3. **质量控制系统**
建议建立多指标实时监测体系：
- 每12小时检测：NH4+浓度、acetoin/2-3-BDO比值（应＞3.2）
- 每24小时检测：总酸（目标值12-14 g/L）、SO2残留量（＜50 mg/L）
- 关键代谢物预警：若异丁醇＞8 mg/L时启动补加EDTA（0.1 g/L）干预

### 展望与挑战
1. **代谢通量深度解析**
建议结合13C同位素标记和质谱流式联用技术，量化 acetoin合成途径的13C代谢流分布（目前研究仅完成基因层面的调控网络分析）。

2. **工程菌株稳定性验证**
需开展连续传代（≥50代）和压力测试（温度＞35℃、pH波动±0.5），评估BY07的遗传稳定性。当前研究显示其遗传漂移率（SD）<0.8%。

3. **法规与市场适配**
需解决GMO法规限制（如欧盟EU27禁止转基因酵母用于食品发酵），建议开发表观调控型菌株（如通过CRISPRi/i系统实现基因表达的动态调节），避免直接敲除关键代谢基因。

该研究不仅为风味定制型酵母菌种开发提供了理论依据和技术范式，更在工业转化层面提出了可操作的工艺优化方案。其建立的“代谢指纹-通量模型-工程菌株”三位一体研发体系，标志着合成生物学在食品工业中的应用进入精准调控的新阶段。后续研究可重点关注氮代谢酶的构效关系优化，以及工程菌株在复式发酵（主发酵+后熟）中的长期稳定性验证。