转录组分析揭示了与香菇（Lentinula edodes）采后软化相关的细胞壁多糖代谢机制

《LWT》：Transcriptomic analysis reveals cell wall polysaccharide metabolism associated with post-harvest softening in shiitake mushrooms ( Lentinula edodes)

香菇采后软化机制及关键代谢通路研究。通过转录组测序和酶活性分析，发现12d储存期细胞壁多糖（TP、WSP、NSP等）显著降解，β-1,3-葡萄糖苷酶、纤维素酶和几丁质酶活性分别增加3.5倍、2.8倍和4.2倍。KEGG富集分析显示淀粉/蔗糖代谢（42基因）、糖酵解/生糖作用（46基因）、氨基酸糖苷代谢（38基因）等通路关键调控。qRT-PCR验证LeBGLU、LeCEL、LeCHI2等基因表达与酶活性呈显著正相关。研究揭示了多糖降解与氧化磷酸化协同驱动软化的分子机制。

　　
本研究聚焦于香菇（*Lentinula edodes*）后熟软化过程的分子机制解析。通过系统性分析细胞壁多糖降解、关键酶活性变化及转录组特征，揭示了香菇软化的多维度调控网络。研究发现，在10℃储存12天过程中，香菇硬度从初始的311N骤降至192N，降幅达38.6%，与细胞壁多糖（CWPs）含量下降及纤维素酶、β-1,3-葡萄糖苷酶、壳聚糖酶等胞壁降解酶活性显著上升直接相关。值得注意的是，这些变化并非单一因素驱动，而是涉及糖代谢、氧化磷酸化、自噬调控等12条核心代谢通路协同作用的结果。

### 一、细胞壁成分动态变化与酶活性关联
储存期间，总多糖含量（TP）呈现持续下降趋势，12天时较初始下降42.3%。其中，中性可溶多糖（NSPs）和1mol/L NaOH可溶多糖（1-OHSPs）降幅达65.8%，而HCl/NaOH可溶多糖（HCl-OHSPs）却显著增加（+58.9%），这提示细胞壁多糖在储存过程中发生结构性重组。特别值得关注的是，β-1,3-葡萄糖苷酶活性在储存6天后即上升3.2倍，至第12天达到峰值（8.7×10?? U/g FW），其活性与硬度下降呈显著负相关（r=-0.92）。同时，纤维素酶活性在储存后期（9-12天）呈现指数级增长，与纤维素含量下降形成负反馈调控。这种酶活性与底物含量的动态平衡，揭示了细胞壁降解的级联反应机制。

### 二、转录组特征揭示代谢网络重构
高通量转录组测序共鉴定出9139个差异表达基因（DEGs），其中3,954个在12天储存期较对照组显著上调。KEGG富集分析显示，氧化磷酸化（ko00190）、糖酵解/生糖作用（ko00010）、氨基糖苷代谢（ko00520）三条通路富集度最高（FDR<0.05），分别有65、42、38个DEGs。值得注意的是，糖原代谢（ko00500）和果糖-甘露糖代谢（ko00051）中同时存在上调与下调基因，这种双向调控可能通过调节中间产物（如葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸）的代谢平衡实现细胞壁稳态的动态调节。

### 三、关键酶基因表达谱与功能解析
1. **β-1,3-葡萄糖苷酶系统**：包含LeBGLU（1,3-β-D-葡萄糖苷酶）、LeBGL2（β-1,3-葡萄糖苷酶）等5个核心酶基因。其中LeBGL2在储存12天时表达量达初始水平的8.3倍，且与HCl-OHSPs含量呈显著正相关（r=0.87），表明该酶可能参与细胞壁中β-1,6-侧链的剪切。值得注意的是，LeBGLU在储存6天后表达量下降42%，提示该酶可能参与细胞壁合成与降解的平衡调控。

2. **纤维素酶复合体系**：LeCEL（纤维素酶）基因在12天时表达量较初始提升3.5倍，其活性与纤维素含量呈显著负相关（r=-0.89）。通过qRT-PCR验证发现，LeCEL基因表达与纤维素酶活性存在0.92的正相关，证实转录组数据可靠性。

3. **壳聚糖代谢通路**：LeCHS（壳聚糖合成酶）与LeCNS（壳聚糖酶）构成动态调控对。储存12天时，LeCNS表达量较初始提升7.2倍，而LeCHS表达量下降38%，这种合成与降解的失衡直接导致HCl-OHSPs（壳聚糖相关组分）积累。通过酶活性测定发现，壳聚糖酶活性在12天时达峰值（4.8×10?? U/g FW），其与HCl-OHSPs含量呈0.91的正相关。

### 四、代谢通路的协同调控机制
研究揭示了四重协同调控网络：
1. **能量供应轴**：Hexokinase（LeHEX）在储存后期表达量激增（12天达初始的6.8倍），通过磷酸化葡萄糖维持糖代谢通量。与之呼应，Pyruvate kinase（LePYK）活性在12天时达峰值，将糖酵解与三羧酸循环连接，形成能量代谢的闭环系统。

2. **氧化磷酸化驱动轴**：KEGG分析显示，该通路富集了76个DEGs，包括线粒体电子传递链相关基因（如COX2、NDUFA5）。通过 Pearson分析发现，氧化磷酸化相关基因表达量与细胞壁降解速率呈0.83的正相关（P<0.01），提示线粒体ATP合成可能为胞壁降解提供能量支撑。

3. **自噬调控轴**：自噬相关基因（如ATG1、ATG5）在储存后期表达量提升，与β-1,3-葡萄糖苷酶活性形成正反馈。这种自噬激活可能通过释放胞壁降解所需的离子和底物（如钙离子、葡萄糖）来促进细胞壁重构。

4. **交叉保护轴**：研究首次发现香菇在储存过程中存在独特的交叉保护机制。例如，β-1,3-葡萄糖苷酶（LeBGL2）与纤维素酶（LeCEL）活性呈显著负相关（r=-0.76），这种竞争性抑制可能维持细胞壁的结构完整性，防止过度降解。

### 五、品质劣变的关键调控节点
通过系统生物学分析，识别出5个关键调控节点：
1. **LeEGL1（endo-1,3-β-葡萄糖苷酶）**：其活性在储存6天后达峰值，与1-OHSPs（碱溶性多糖）含量下降形成直接关联。该酶通过水解β-1,3-葡萄糖苷键，使原本稳定的β-1,3-1,6-交联结构解体。

2. **LeCNS（壳聚糖酶）**：作为细胞壁降解的终末酶，其活性在12天时达最高值（4.8×10?? U/g FW），催化壳聚糖脱乙酰基生成壳聚糖，该产物在强酸条件下可溶，导致细胞壁结构松散。

3. **LeHEX（己糖激酶）**：作为糖代谢的启动酶，其表达量在储存后期（9-12天）显著提升，通过调控葡萄糖磷酸化进入后续代谢途径，为胞壁降解提供底物支持。

4. **LeBGL3（β-1,3-葡萄糖苷酶）**：该酶在储存6天后开始表达，其活性与NSPs（中性可溶多糖）含量呈显著负相关（r=-0.79），提示其可能参与细胞壁水溶性组分的释放。

5. **LeCNS（壳聚糖酶）**与**LeCHI2（壳聚糖酶Ⅱ）**的协同作用：通过质谱分析发现，两者共同作用可水解壳聚糖的β-1,4-糖苷键，使原本坚硬的细胞壁结构崩解。

### 六、应用转化潜力
基于上述发现，提出三项品质改良策略：
1. **酶活性抑制技术**：通过基因编辑沉默LeBGL2、LeCNS等关键酶基因，可使储存12天的硬度保持初始的82%以上。
2. **代谢通路调控**：抑制糖酵解（ko00010）和氧化磷酸化（ko00190）关键基因表达，可延缓多糖降解进程达40-60%。
3. **自噬激活技术**：过表达ATG1基因可使储存期延长3-5天，同时保持80%以上的初始硬度。

### 七、研究创新点
本研究首次系统揭示了香菇后熟软化的时空特异性代谢调控网络：
- 发现储存6-9天是细胞壁重构的关键窗口期，此阶段β-1,3-葡萄糖苷酶活性上升与纤维素酶活性启动形成时间差。
- 揭示HCl-OHSPs的积累具有双重性：既作为降解终产物标志物，又可能通过激活NLRP3炎症小体通路促进细胞壁修复。
- 建立首个香菇细胞壁降解酶活性-基因表达-代谢通路的定量模型（R2=0.93），为精准调控提供理论依据。

### 八、未来研究方向
1. **动态代谢网络建模**：整合转录组、蛋白质组及代谢组数据，构建多维度的细胞壁降解预测模型。
2. **表观遗传调控机制**：探究DNA甲基化（如LeBGL2基因启动子区CpG岛甲基化程度）在储存期基因表达调控中的作用。
3. **合成生物学调控**：设计双调控系统，如将LeCNS基因置于诱导型启动子控制下，实现降解酶活性与合成酶活性的精准平衡。

该研究为食用菌采后生理机制提供了新的理论框架，其揭示的"代谢冗余-需求失衡"调控模型，不仅解释了香菇软化的分子机制，更为开发基于代谢工程改良的优质菌种奠定了理论基础。