从泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）中鉴定并验证一种新型抗氧化肽：结合肽组学、分子模拟和体外功能测定方法

《LWT》：Identification and validation of a novel antioxidant peptide from loach ( Misgurnus anguillicaudatus): Integrating peptidomics, molecular simulation, and in vitro functional assays

抗氧化肽、鲈鱼肽、酶解法、质谱分析、Nrf2信号通路、分子对接、细胞保护、自由基清除、生物信息学、安全无毒

　　
本研究针对中国淡水经济鱼类中华绒螯蟹（*Misgurnus anguillicaudatus*）的抗氧化活性肽进行系统解析与功能验证，首次报道了通过酶解优化结合多组学分析筛选出的新型抗氧化多肽Tn（序列：GFGGGMGGGFGGGMGMG）。研究通过蛋白质组学、分子模拟和体外抗氧化实验，揭示了该多肽通过调控Nrf2信号通路发挥抗氧化作用的核心机制，为开发天然抗氧化剂提供了新思路。

### 1. 研究背景与科学价值
中华绒螯蟹作为我国重要水产资源，其肌肉蛋白含量高达17%（体重百分比），但传统加工方式难以提取具有生物活性的小分子肽。已有研究表明，水产蛋白酶解产物富含抗氧化、抗疲劳及抗癌活性肽，但具体功能多肽的精准筛选仍存在技术瓶颈。本研究创新性地引入肠激酶协同消化体系，通过优化酶解工艺获得高纯度生物活性肽，并采用多组学联用技术实现功能肽的靶向筛选。

### 2. 关键技术突破
（1）**酶解工艺创新**：在传统胰蛋白酶解体系中加入肠激酶（1%比例），显著提高多肽得率（达56.62%）。该工艺通过双重酶解机制，既保持肽段结构完整性，又促进特定活性片段的生成，有效规避了单一酶解的局限性。

（2）**多组学筛选体系**：构建包含蛋白质组学（LC-MS/MS）与生物信息学（GO/COG/KEGG富集分析）的双重筛选模型。通过MaxQuant定量分析发现，酶解组较对照组多产生8.3倍生物活性肽，其中与抗氧化相关的功能肽占比达62.7%。结合PeptideRanker（评分>0.5）和ToxinPred（非毒性）双重筛选机制，最终锁定Tn作为候选多肽。

（3）**分子模拟技术**：采用AlphaFold3（置信度pLDDT>90）进行结构预测，通过MM-GBSA计算显示Tn与Nrf2蛋白的相互作用自由能达-12.3 kcal/mol（低于临界值-8.0 kcal/mol）。分子动力学模拟证实，Tn与Nrf2形成的复合物在100 ns模拟周期内保持RMSD稳定（波动范围±0.15 ?），且关键结合残基（如Leu313-Phe10、Met6-Arg34）形成氢键网络（总结合位点数达7.2个/μmol）。

### 3. 核心功能验证
（1）**体外抗氧化活性**：
- DPPH清除率：在400 μg/mL浓度下达89.7%（接近阳性对照谷胱甘肽92.1%）
- ABTS清除率：浓度依赖性曲线显示半抑制浓度（IC50）为83.2 μg/mL
- FRAP铁还原能力：等效于1.8 mg TE/g（ Trolox当量）
- 独创性采用"三重验证法"（自由基清除+金属螯合+脂质过氧化抑制），首次建立水产肽抗氧化活性综合评价体系。

（2）**细胞保护机制**：
- HUVEC氧化损伤模型显示，100 μg/mL Tn使细胞存活率从对照组的68.7%提升至95.3%
- 抗氧化酶活性协同增强：SOD活性提升145.5%（p<0.01），GR活性提升77.5%（p<0.05）
- 损伤标志物显著降低：MDA含量减少41.2%（p<0.01），ROS水平下降33.1%（p<0.01）
- 细胞凋亡率从对照组的58.2%降至12.4%（p<0.001）

### 4. 分子作用机制解析
（1）**Nrf2信号通路调控**：
- 分子对接显示Tn与Nrf2的KEAP1结构域形成8个稳定结合位点（包括4个氢键、3个疏水作用和1个水桥）
- 动态模拟揭示关键残基（Arg34、Trp24）的构象适应性，当Tn浓度超过200 μg/mL时，受体构象稳定系数（Cα RMSF）提升至0.87（p<0.05）

（2）**抗氧化分子网络构建**：
- 建立包含12个关键蛋白（如Heme oxygenase-1、NAD(P)H quinone oxidoreductase1）的调控网络
- 通过荧光淬灭实验证实Tn可激活Nrf2/ARE通路，使下游抗氧化基因表达量提升2.3-3.8倍

### 5. 应用潜力与产业化路径
（1）**功能食品开发**：建议采用喷雾干燥-微胶囊包埋技术（粒径<500 nm）提高肽的消化道稳定性，预测生物利用度可达72.3%（基于Caco-2模型）。

（2）**医药延伸价值**：通过建立类器官模型（含肝、肺、肾微环境），发现Tn可使器官抗氧化酶活性同步提升（增幅达35-58%），提示其具有系统级抗氧化潜力。

（3）**生产工艺优化**：开发分段酶解-膜分离联用工艺，使肽得率从单酶解的18.7%提升至41.2%，成本降低62.4%（基于100吨原料规模测算）。

### 6. 研究局限与未来方向
（1）**体内转化机制不明**：需通过LC-MS/MS技术追踪肠道吸收后的肽段代谢轨迹，特别是跨膜转运蛋白（如PEPT1）的介导作用。

（2）**长期安全性待验证**：建议开展6个月慢性毒性实验，重点监测肝细胞SOD同工酶（Cu/Zn-SOD、Mn-SOD）的动态变化。

（3）**功能复合物开发**：结合冷冻电镜技术解析Tn与Nrf2-Keap1复合物的三维结构，为设计小分子竞争性抑制剂提供靶点信息。

本研究突破传统水产肽研究范式，首次实现从原料酶解到功能验证的完整技术链创新。Tn多肽的发现不仅拓展了水产副产物高值化利用路径，更为开发靶向抗氧化药物提供了天然模板。后续研究建议聚焦于肠肝轴调控机制和临床转化应用场景的深度开发。