CD18酪氨酸735位点磷酸化通过下调Akt活性介导胸膜肺炎放线杆菌ApxI毒素细胞毒性的机制研究

《Scientific Reports》：Phosphorylation of the β2 integrin subunit CD18 contributes to Actinobacillus pleuropneumoniae ApxI-induced cytotoxicity through the downregulation of Akt activity

本研究针对胸膜肺炎放线杆菌主要毒力因子ApxI如何通过β2整合素LFA-1诱导细胞死亡的机制难题，系统阐明了CD18亚基Y735位点磷酸化状态通过调控Akt信号通路介导细胞毒性的新机制。研究发现磷酸化模拟突变体CD18Y735D可增强ApxI毒性，而非磷酸化突变体CD18Y735P则通过维持Akt活性减弱细胞死亡，首次揭示了CD18酪氨酸磷酸化与Akt信号衰减在RTX毒素致病中的因果联系。

　　

在养猪业中，有一种被称为"猪呼吸道杀手"的传染病——猪传染性胸膜肺炎，其病原体是胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）。这种细菌能够产生多种毒素，其中ApxI毒素是其最强的毒力因子之一，能够导致肺组织出血、坏死和纤维化，给养殖业造成巨大经济损失。尽管科学界早已知道ApxI毒素对免疫细胞有强大杀伤作用，但这种毒素究竟如何精准识别靶细胞并触发细胞死亡信号，一直是微生物致病机制研究的难点。

传统观点认为，白细胞特异性表达的β₂整合素家族可能是ApxI毒素的受体，尤其是淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1，由CD11a和CD18亚基组成）。然而，ApxI毒素如何与LFA-1相互作用，以及这种相互作用如何转化为细胞内的死亡信号，仍然存在许多未解之谜。更令人困惑的是，研究发现ApxI毒素能够抑制细胞内的Akt信号通路——这是一条重要的细胞生存信号通路，但Akt活性下降是否是导致细胞死亡的直接原因，还是仅仅是伴随现象，尚无定论。

为了解决这些科学问题，来自国立中兴大学兽医学院兽医病理生物学研究所的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们聚焦于CD18亚基胞质尾区的酪氨酸735（Y735）位点——这是已知的CD18关键磷酸化位点，探讨了该位点的磷酸化状态是否在ApxI毒素诱导的细胞毒性中发挥关键作用。

关键技术方法包括：通过免疫共沉淀验证ApxI与LFA-1的直接相互作用；利用基因工程技术构建野生型和突变型（Y735D和Y735P）CD18表达载体；通过细胞转染技术在ApxI不敏感的人胚胎肾293（HEK293）细胞中重建porcine LFA-1表达系统；采用乳酸脱氢酶（LDH）释放实验定量检测细胞毒性；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白质印迹法（Western blot）分析Akt磷酸化水平；使用流式细胞术检测细胞表面受体表达。研究中使用的猪肺泡巨噬细胞来源于6-8周龄无特定病原体猪只。

2.1 具有生物活性的ApxI与猪LFA-1相互作用

研究人员首先通过免疫共沉淀实验证实了ApxI毒素确实能够与猪肺泡巨噬细胞中的LFA-1发生特异性结合。实验结果显示，天然的ApxI能够与CD11a和CD18共同沉淀，而从不能产生ApxI的突变菌株ApxIA336获得的培养上清则无此作用。更重要的是，当ApxI经热处理失活后，其与CD11a和CD18的结合能力分别下降至26.5%和46.0%，表明ApxI的生物活性对其与LFA-1的相互作用至关重要。

2.2 猪CD18部分介导ApxI细胞毒性

为了解析LFA-1中两个亚基在ApxI毒性中的作用，研究团队在HEK293细胞中分别转染CD18、CD11a或两者同时转染。结果发现，共表达CD11a和CD18的细胞对ApxI最为敏感，细胞毒性高达46.4-75.5%。令人惊讶的是，仅表达CD18的细胞也表现出10.9%-40.8%的细胞毒性，显著高于仅表达CD11a或空载体对照的细胞。流式细胞术分析显示，单独转染CD18的细胞有11%能在细胞表面表达CD18，而单独转染CD11a的细胞仅有1%能表面表达CD11a，表明CD18在介导ApxI毒性中起主导作用。

2.3 非磷酸化模拟的CD18Y735P突变降低对ApxI的敏感性

研究人员构建了模拟持续磷酸化状态的CD18^Y735D突变体和模拟非磷酸化状态的CD18^Y735P突变体。实验结果表明，表达CD18^Y735D的细胞对ApxI最为敏感，细胞毒性达49.5%-73.2%；而表达CD18^Y735P的细胞毒性最低（29.8%-61.9%），且在低浓度ApxI（0.6和1.3 CU/ml）下与野生型有显著差异。这表明CD18酪氨酸735位点的磷酸化状态确实影响ApxI的细胞毒性。

2.4 CD18Y735磷酸化介导ApxI诱导的Akt活性衰减

通过ELISA检测Akt磷酸化水平（S473位点），研究发现ApxI处理能够显著降低LFA-1转染的HEK293细胞中Akt的活性。更重要的是，在表达CD18^Y735P突变的细胞中，ApxI引起的Akt活性下降程度最弱，而CD18^Y735D突变体与野生型CD18引起的Akt衰减程度相当。这证明CD18Y735位点的磷酸化是ApxI诱导Akt活性衰减的关键环节。

2.5 Akt衰减促进ApxI诱导的细胞死亡

为了验证Akt活性下降是否直接导致细胞死亡，研究人员通过两种策略提升细胞内的Akt活性：一是表达持续活跃的PI3K催化亚基p110（p110），二是外源过表达Akt。结果发现，尽管ApxI处理仍能部分降低Akt活性，但提升Akt活性确实能够显著减轻ApxI引起的细胞毒性。例如，在2.5 CU/ml ApxI处理下，共转染p110*的细胞毒性比仅转染LFA-1的细胞降低了约5-6%。这表明Akt信号通路的抑制确实是ApxI诱导细胞死亡的机制之一。

综合讨论与结论表明，本研究首次系统地阐明了ApxI毒素通过LFA-1受体诱发细胞死亡的分子机制。研究发现不仅证实了CD18亚基在介导ApxI毒性中的核心作用，还揭示了CD18酪氨酸735位点磷酸化的关键调控功能。更重要的是，研究建立了CD18磷酸化与Akt信号通路之间的联系，证明ApxI通过促进CD18Y735磷酸化，进而抑制Akt生存信号，最终导致细胞死亡。

这一发现对理解RTX毒素家族（包括ApxI、Lkt等）的致病机制具有重要理论意义。不仅揭示了β₂整合素在细菌毒素致病中的新功能，还为未来开发针对胸膜肺炎放线杆菌感染的新型治疗策略提供了潜在靶点。例如，针对CD18酪氨酸735位点的特异性抑制剂，或者增强Akt活性的治疗手段，可能成为对抗这种重要猪病原体的新思路。

研究的创新点在于将细菌毒素的受体识别、整合素信号转导和细胞生存信号通路有机联系起来，构建了一个完整的致病机制框架。尽管研究使用了上皮来源的HEK293细胞作为模型系统，这可能在一定程度上限制了研究结果在免疫细胞特异性功能方面的外推，但这一模型成功地复现了ApxI在原代猪肺泡巨噬细胞中观察到的关键表型，为研究β₂整合素的基本信号转导机制提供了有力工具。

未来研究可以进一步探索负责CD18Y735磷酸化的特异性酪氨酸激酶，以及这一事件如何精确调控下游Akt信号的具体分子机制。这些深入的研究将为我们全面理解细菌毒素与宿主免疫系统的相互作用提供更多重要见解。