泰国猪鼻蝠新型SSR标记开发及种群遗传多样性研究

《Scientific Reports》：Development and cross-amplification of novel SSR markers for population genetic analysis of Kitti’s hog-nosed bat (Craseonycteris thonglongyai) in Thailand

本研究针对濒危物种基蒂猪鼻蝠(Craseonycteris thonglongyai)开发了68个新型SSR标记，其中6个呈现多态性。结合已有标记对泰国57个样本分析显示，该种群具有中等遗传多样性(平均He=0.486)。种群结构分析表明不同洞穴个体存在基因交流(PhiPT=0.128)。标记在3个科蝙蝠中成功跨种扩增，为翼手目保护遗传学研究提供了重要工具。

　　

在泰国西部的石灰岩洞穴中，栖息着世界上最小的哺乳动物之一——基蒂猪鼻蝠(Craseonycteris thonglongyai)。这种仅重2克的微型蝙蝠是Craseonycteridae科的唯一种类，由于分布范围极度受限（仅见于泰国和缅甸边境的少数洞穴），种群数量稀少且持续下降，被世界自然保护联盟（IUCN）列为近危物种。近年来，随着旅游开发、蝙蝠粪采集等人类活动的增加，这一珍稀物种的生存状况令人担忧。

由于猪鼻蝠种群数量稀少且分布范围狭窄，其遗传多样性水平及种群结构特征一直缺乏系统研究。而了解这些遗传参数对制定有效的保护策略至关重要。传统的形态学方法难以准确评估这种微型蝙蝠的种群状况，分子标记技术的应用为解开这一谜题提供了新的可能。在此背景下，由Mahidol大学Supajit Sraphet领衔的研究团队在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果，通过开发新型微卫星标记（SSR）首次对泰国猪鼻蝠种群进行了全面的遗传多样性评估。

研究人员采用了几项关键技术方法：通过构建富含(GT)₁₂/(CTG)₉和(AG)₁₂/(CAG)₉探针的基因组文库开发SSR标记；从泰国三个洞穴（Lum-Yai、Manao-Pee和Pha）采集57个猪鼻蝠翼膜样本进行DNA分析；使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术进行基因分型；利用Cervus、Genepop等软件进行种群遗传参数计算；并通过UPGMA、PCoA和STRUCTURE分析种群结构。

样本收集

研究团队于2010-2015年间在泰国沙没府Sai Yok地区的三个洞穴（Lum-Yai、Manao-Pee和Pha）共采集了57个猪鼻蝠个体（28雄29雌）。此外，还收集了同域分布的其他蝙蝠物种样本，包括 Hipposideridae科的Hipposideros armiger和H. pomona、Vespertilionidae科的Myotis siligorensis、Rhinolophidae科的Rhinolophus affinis、R. coelophyllus和R. malayanus，以及Emballonuridae科的Taphozous melanopogon，用于后续的跨种扩增分析。

微卫星特征分析与引物设计

通过构建富集文库，研究人员获得了253个成功测序的克隆，其中188个（74.3%）含有SSR motif。分析发现，二核苷酸重复（AG和GT）占主导（79.4%），三核苷酸重复（CTG和CAG）占20.6%。基于这些序列，团队设计了68对SSR引物（登录号：MK605520-MK605587），其中28对（41.18%）在猪鼻蝠中成功扩增，6对（21.43%）呈现多态性。

遗传多样性分析

结合Puechmaille等人此前开发的16个SSR标记中的4个多态性位点，本研究共使用10个多态性SSR位点对57个猪鼻蝠样本进行分析。结果显示，共检测到48个等位基因，平均每个位点4.8个等位基因。观察杂合度（H_o）平均为0.506，期望杂合度（H_e）平均为0.486，多态信息含量（PIC）平均为0.494，表明泰国猪鼻蝠种群具有中等水平的遗传多样性。三个位点（Ct32、Ct52和CTA7）显著偏离Hardy-Weinberg平衡（P≤0.05），平均近交系数（F_IS）为0.087，提示存在轻微的杂合子缺失现象。

系统发育树、PCoA和种群结构

分子方差分析（AMOVA）显示，猪鼻蝠的遗传变异主要来源于种群内部（87%），种群间分化程度较低（PhiPT=0.128）。UPGMA系统发育树和主坐标分析（PCoA）均未发现基于洞穴来源的明显聚类模式，表明不同洞穴个体间存在基因交流。

跨种转移性

10个多态性SSR标记在其他蝙蝠科中的跨种扩增测试显示，6个标记（Ct32、Ct52、Ct55、Ct64、CTA4和CTD114）至少在Hipposideridae、Vespertilionidae或Rhinolophidae科中的一个物种中成功扩增。其中，Ct32在五个物种（H. armiger、H. pomona、R. affinis、R. coelophyllus和R. malayanus）中均表现出良好的转移性。

研究结论表明，泰国猪鼻蝠种群目前保持着中等水平的遗传多样性，种群间分化程度较低，这可能与洞穴间存在一定程度的基因流（Nm=1.706）有关。虽然当前近交水平较低，但种群数量的持续下降仍需要密切关注。新开发的SSR标记不仅为猪鼻蝠的保护遗传学研究提供了有力工具，而且在亲缘关系较近的蝙蝠科中表现出良好的跨种扩增能力，这对其他稀有蝙蝠物种的遗传多样性研究具有重要意义。

这项研究首次系统评估了泰国猪鼻蝠种群的遗传状况，为这一濒危物种的保护管理提供了科学依据。研究人员建议持续监测种群遗传动态，及时发现近交风险，并采取措施减少人类活动对洞穴栖息地的干扰。这些新开发的分子标记工具将有助于未来更深入地了解猪鼻蝠的进化历史、种群连通性和适应性潜力，为制定有效的保护策略奠定基础。