蛇毒纳米毒理学新视角：眼镜蛇与圆斑蝰细胞外囊泡的功能与生化特性揭示

《Scientific Reports》：Unveiling the nanotoxicology of snake venoms through functional and biochemical characterization of extracellular vesicles from Naja naja and Daboia russelii

本研究针对蛇毒毒素递送机制不清的问题，通过功能与生化表征比较眼镜蛇(Naja naja)和圆斑蝰(Daboia russelii)毒液及其细胞外囊泡(EVs)对凝血系统(PT/aPTT)、红细胞溶血及嘌呤能酶(ATPase/ADPase)活性的影响。发现EVs能显著增强毒液抗凝活性，呈现性别特异性溶血差异，并有效调控能量代谢关键酶。该研究为阐明蛇毒EVs的纳米毒理学机制及改进抗蛇毒血清策略提供了新见解。

　　

在全球热带地区，蛇咬伤是一个被严重低估的公共卫生危机，每年导致数万人死亡，其中印度因"四大毒蛇"——眼镜蛇(Naja naja)、圆斑蝰(Daboia russelii)等造成的伤害尤为突出。传统上，蛇毒被视为可溶性蛋白质的混合物，但近年来科学家们在蛇毒中发现了一类新的活性载体——细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)。这些纳米级别的囊泡可能通过保护毒素成分、增强其稳定性及靶向性，在中毒过程中扮演着关键角色。然而，不同蛇种毒源EVs的功能特性有何差异？它们是否会改变乃至放大毒液的毒性效应？这些问题亟待解答。

为了深入探索蛇毒的纳米毒理学机制，来自印度卡斯特尔巴医学院的研究团队在《Scientific Reports》上发表了最新研究。他们系统比较了眼镜蛇和圆斑蝰的粗毒及其EVs在关键生理过程中的作用，旨在揭示EVs作为功能性毒素递送单元的重要性。

研究人员首先在获得相关许可后，采集了眼镜蛇和圆斑蝰的毒液，并使用超速离心法分离其中的EVs。他们通过纳米颗粒追踪分析(NTA)和透射电子显微镜(TEM)对分离的EVs进行了表征。NTA显示眼镜蛇毒EVs平均尺寸为199.1纳米，圆斑蝰毒EVs为207纳米。TEM图像则清晰展示了EVs的双层膜结构。Western blotting分析进一步证实了EVs标志物CD63和TSG101的表达，同时也检测到内质网标志物HSP90β，这可能与蛇类处于应激状态或该蛋白在制备过程中共分离有关。蛋白质浓度测定显示，粗毒蛋白浓度远高于其EVs组分。

在关键的乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)活性检测中，研究人员发现，眼镜蛇粗毒(NNSV)及其EVs(NNEV)均表现出AChE活性，且在多数浓度下活性相当，甚至EVs在某些浓度下显示出略高的趋势，表明EVs能够保留甚至可能增强粗毒的酶功能。相比之下，以血循毒为主的圆斑蝰粗毒(DRSV)及其EVs(DREV)也检测到了一定的AChE活性，且DREV在5-40微克/毫升浓度范围内的活性略高于DRSV。这一发现提示，即使在AChE非主要毒素的蛇种中，EVs也可能作为保存和递送酶功能的载体。

凝血功能检测结果更为复杂。在凝血酶原时间(Prothrombin Time, PT)实验中，圆斑蝰粗毒(DRSV)在低浓度(5微克/毫升)即可引起PT的急剧延长，而其EVs(DREV)在最高浓度时表现出最强的抗凝效果。眼镜蛇粗毒(NNSV)对PT的延长作用呈剂量依赖性渐进增加，但其EVs(NNEV)在低浓度就表现出强烈的抗凝活性，随后进入平台期。在活化部分凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time, aPTT)检测中，眼镜蛇粗毒和EVs以及圆斑蝰粗毒在5微克/毫升时均使aPTT显著延长至85-90秒，并在更高浓度维持平台效应。然而，圆斑蝰EVs(DREV)却表现出独特的剂量依赖性促凝效应，aPTT随浓度增加而缩短。这表明EVs可能选择性富集了特定的促凝或抗凝成分，从而改变了其粗毒的整体凝血表现。

溶血实验揭示了一个引人注目的现象：性别差异性。无论是粗毒还是EVs，对女性红细胞均表现出更强的溶血活性。其中，圆斑蝰粗毒(DRSV)及其EVs(DREV)的溶血活性最高，显著高于眼镜蛇对应样本。眼镜蛇EVs(NNEV)的溶血活性也高于其粗毒(NNSV)。而在男性红细胞中，所有样本的溶血活性均远低于女性。这种性别特异性可能与性激素水平影响红细胞膜特性有关，例如雌激素可能改变膜脂质排列，影响毒素插入。

在研究能量代谢相关的嘌呤能酶活性时，研究人员有了更重要的发现。ATP酶(ATPase)和ADP酶(ADPase)活性检测显示，两种蛇毒的EVs其酶活性均显著高于其对应的粗毒。眼镜蛇EVs(NNEV)的ATP酶和ADP酶活性在所有样本中最高，并且在2小时孵育后活性仍能维持甚至略有增强。圆斑蝰EVs(DREV)也表现出高于其粗毒(DRSV)的酶活性。这表明EVs的脂质双层膜结构可能有效保护了这些酶的活性，使其能够持续发挥作用。ATP酶活性升高可能通过破坏宿主细胞的能量稳态和离子梯度而加剧毒性，而ADP酶(又称apyrase)活性则能水解ADP，抑制血小板聚集，可能导致出血倾向加重。

综上所述，本研究有力地证明，蛇毒细胞外囊泡并非惰性载体，而是具备显著生物活性的功能性纳米单元。它们不仅能够携带并保护多种毒素酶（如AChE, ATPase, ADPase），还能通过其独特的递送机制，增强或改变粗毒在凝血、溶血及能量代谢等方面的毒性效应。特别是发现的性别特异性溶血以及EVs对凝血途径的复杂调控，揭示了蛇毒毒理学的新维度。这些发现挑战了对蛇毒的传统认知，强调了在蛇伤病理生理学及抗蛇毒血清研发中考虑EVs的重要性。EVs的保护作用可能使得其中包裹的毒素在体内存留时间更长，甚至可能逃避常规抗蛇毒血清的中和，这为理解难治性蛇伤症状提供了新线索。未来研究需要进一步探索EVs在体内的分布、靶向性及其与宿主细胞的相互作用，以期开发出针对EVs的新型治疗策略，最终为降低蛇咬伤致残率和死亡率开辟新的道路。