结合活细胞成像的高通量原位单细胞端粒长度定量新方法揭示干细胞端粒动态

《Journal of Molecular Cell Biology》：A high-throughput method for quantifying relative telomere length in single cells in situ combined with live-cell imaging

本刊推荐：为解决传统端粒长度测量方法无法在单细胞水平结合动态过程分析的问题，研究人员开发了LiHt-QFISH技术，成功将活细胞成像与高通量定量FISH相结合。研究发现小鼠胚胎干细胞退出2C-like状态时发生端粒特异性延长，揭示了端粒缩短可能通过激活DNA损伤反应触发细胞进入2C-like状态的新机制，为细胞衰老和再生医学研究提供了强大工具。

　　

细胞为什么会衰老？这个问题的答案部分隐藏在染色体末端被称为"端粒"的特殊结构里。大多数体细胞在经历约50次分裂后就会停止增殖，这一现象被称为"海弗利克极限"。自从被发现以来，科学家们逐渐认识到，端粒——这些保护染色体末端的重复DNA序列和相关蛋白质——随着每次细胞分裂而逐渐缩短，最终触发细胞衰老或死亡。然而，某些细胞类型如胚胎干细胞、生殖细胞和一些癌细胞，能够通过端粒酶或替代性延长机制来抵抗这种缩短。因此，端粒长度已成为衡量细胞衰老和增殖能力的经典标志物。

尽管端粒在衰老过程中的核心作用已明确，但传统的研究方法存在明显局限。定量PCR(qPCR)和末端限制性片段(TRF)分析等技术只能进行群体水平比较，而流式荧光原位杂交(Flow-FISH)虽能在单细胞水平分析，却在样品处理过程中丢失了空间信息，且无法与活细胞成像兼容。这些技术瓶颈限制了我们深入理解端粒长度如何与细胞动态行为相关联。

为了突破这些限制，孙庆阳、邹正智和闵明伟等研究人员在《Journal of Molecular Cell Biology》上发表了一项创新研究，开发了一种名为LiHt-QFISH的新技术平台。该技术巧妙地将活细胞成像与高通量定量荧光原位杂交(FISH)相结合，首次实现了在单细胞水平同时分析端粒长度和细胞动力学行为。

研究人员采用的主要技术方法包括：通过表达组蛋白H2B-荧光蛋白融合的活细胞报告系统进行高通量延时显微成像；在最终成像时间点立即固定细胞并进行端粒FISH处理；利用H2B通道追踪细胞谱系并提取单细胞动力学参数；通过配准FISH前后的H2B图像，将端粒FISH信号与每个细胞的谱系历史和动态行为相匹配。端粒长度量化基于更长端粒含有更多TTAGGG重复序列从而产生更强荧光信号的原理，经过图像校正、分割和信号提取三个步骤完成。

方法验证与可靠性评估

研究团队通过多角度验证了LiHt-QFISH方法的准确性。初步验证显示定量数据忠实再现了原始FISH染色模式，清晰显示出不同细胞间端粒信号强度的差异。有趣的是，来自同一谱系的四个细胞表现出不同的端粒信号强度，暗示小鼠胚胎干细胞(mES)可能不对称地将损伤更严重的端粒分离到一个子细胞谱系中——类似于酵母中损伤成分的不对称分配现象。

生物学验证进一步证实了方法的可靠性。使用人肺上皮基底细胞进行的实验表明，早期传代细胞比晚期传代细胞显示出更亮的端粒焦点，这与原代细胞随传代逐渐缩短端粒的已知事实一致。此外，过表达人端粒酶逆转录酶(hTERT)的基底细胞中端粒强度增强，与hTERT延长端粒的作用相符。这些结果与基于qPCR的端粒长度测量结果一致，共同证明了LiHt-QFISH的可靠性。

应用于mES细胞2C-like状态的端粒动力学研究

研究人员进一步将LiHt-QFISH应用于研究mES细胞二细胞样(2C-like)状态的端粒动力学。约1%的体外培养mES细胞会短暂进入这种状态，其特征是MERVL和Zscan4的表达，类似于二细胞期胚胎。虽然先前研究表明进入此状态时会发生端粒延长，但精确的时间动态仍不清楚。

通过2C-like报告系统的活细胞成像结合端粒FISH，研究团队获得了突破性发现：端粒延长仅发生在退出2C-like状态的细胞中，相反，进入2C-like状态的细胞相比MERVL阴性mES细胞表现出更短的端粒。这表明端粒延长特异性发生在退出而非进入2C-like状态的过程中。这一结论是其他高通量方法无法获得的，因为退出2C-like状态是一个动态过程，其特征是2C状态标记荧光的逐渐衰减，无法通过简单的分选后染色解析。

机制探讨与生物学意义

这一发现暗示端粒较短的细胞更容易进入2C-like状态，可能作为一种端粒修复机制。支持这一观点的是，化学诱导的DNA损伤已知能促进向2C-like状态的转变。因此，端粒缩短可能通过激活DNA损伤反应触发细胞进入2C-like状态，其中暴露的染色体末端被识别为DNA损伤位点。

研究结论强调，LiHt-QFISH平台成功整合了活细胞成像与高通量单细胞端粒分析。该方法不仅能在单细胞水平准确量化相对端粒长度，还保持了实际可操作性，仅需20倍物镜即可获得可靠成像，同时实现卓越的通量——在单CPU核心上每分钟可完成约3000细胞的定量分析。这种单细胞分辨率、技术可及性和高通量的独特结合，使该方法在研究不同生物学背景下的端粒动力学方面具有特别价值。

该研究的创新之处在于首次实现了端粒长度测量与细胞动态行为的直接关联，为理解端粒在细胞命运决定、衰老和疾病中的作用提供了全新视角。特别是关于2C-like状态端粒动力学的新发现，不仅修正了先前对端粒延长时机的认识，还为理解干细胞如何维持基因组稳定性提供了重要线索。随着进一步应用，这一技术平台有望在基础研究和临床转化中发挥重要作用，推动衰老相关疾病和再生医学领域的发展。