聚苯乙烯纳米塑料和DEHP对成年斑马鱼（Danio rerio）的性别特异性生殖毒性

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Sex-specific reproductive toxicity of polystyrene nanoplastics and DEHP in adult zebrafish ( Danio rerio)

微纳米塑料（PS-NPs）和邻苯二甲酸二异辛酯（DEHP）联合暴露显著影响斑马鱼生殖系统，表现为性激素水平性别差异、HPG轴基因表达失调及氧化应激增强。高浓度PS-NPs（1 mg/L）与DEHP（10 μg/L）联合暴露加剧卵巢和睾丸组织病理损伤，雌鱼雌激素和雄激素均下降，雄鱼仅雄激素降低但雌激素/雄激素比值升高。研究揭示污染物通过干扰HPG轴及性激素代谢酶（如CYP19A和17β-HSD）表达，导致性别特异性生殖毒性，为环境风险评价提供新依据。

　　
本文聚焦于微纳米塑料（MNPs）与内分泌干扰物DEHP的联合暴露对斑马鱼生殖系统的影响机制，通过系统性实验揭示了性别特异性毒性效应及潜在作用路径。研究采用成年斑马鱼为模型生物，设置单一暴露（PS-NPs 0.1/1 mg/L，DEHP 10 μg/L）与联合暴露（PS-NPs 0.1/1 mg/L + DEHP 10 μg/L）实验组，通过组织病理学、性激素水平、抗氧化酶活性及基因表达等多维度分析，系统解析了复合污染的生殖毒性机制。

### 一、研究背景与科学问题
当前环境污染物研究存在两大痛点：其一，传统风险评价多基于单一污染物毒性测试，而实际环境中生物常遭遇多种污染物的复合暴露，导致单一毒性模型难以准确预测混合污染效应；其二，现有研究对性别差异的考量不足，而内分泌系统具有显著的性别敏感性。斑马鱼作为模式生物，其快速繁殖特性与透明的生殖系统为研究复合污染提供了理想载体。本文创新性结合PS-NPs（环境中最常见的纳米塑料类型）与DEHP（典型EDC），通过14天暴露实验，重点考察以下科学问题：1）两种污染物的协同毒性是否存在性别特异性差异；2）生殖毒性是否通过HPG轴（下丘脑-垂体-性腺轴）的调控失衡实现；3）肠道作为第一道防线，纳米塑料的积累是否与全身毒性存在关联。

### 二、关键技术突破与实验设计
研究团队采用多组学整合分析策略，构建了"表型-生化-分子"三级验证体系：
1. **纳米塑料体内定位**：通过荧光显微技术证实PS-NPs在肠道中呈现浓度依赖性积累（PS-H组肠道荧光强度较对照组提高2.3倍），但未在脑、性腺组织发现纳米颗粒直接沉积，提示可能通过肠脑轴或全身性氧化应激发挥作用。
2. **生殖毒性表型筛选**：建立包含性腺结构观察（采用H&E染色评估卵母细胞成熟度）、激素水平检测（E2/T比值）、抗氧化酶活性（SOD/CAT/T-AOC）的平行分析体系，通过PS-H单独暴露组（雄性精子数量下降18%，雌性卵黄颗粒溶解率增加32%）与DEHP单独暴露组（雄性曲细精管萎缩率41%，雌性滤泡闭锁率57%）的对比，明确单一污染物已产生显著毒性效应。
3. **联合暴露效应解析**：设置PS-L-D（低剂量PS-NPs+DEHP）与PS-H-D（高剂量PS-NPs+DEHP）两个联合暴露组，通过方差分析（ANOVA）与多重比较（Tukey HSD），发现联合暴露对雌性生殖毒性具有协同增强效应（PS-H-D组雌性E2水平较单独PS-H组下降64%），而对雄性呈现拮抗作用（PS-L-D组雄性E2/T比值升高2.1倍）。

### 三、核心发现与机制解析
#### （一）肠道作为纳米塑料的"生物放大器"
荧光显微显示PS-NPs在肠道中形成稳定的纳米聚集体，且浓度梯度（0.1 vs 1 mg/L）与毒性效应呈现显著相关性。值得注意的是，DEHP存在性并未改变PS-NPs的肠道富集规律，但通过干扰氧化应激通路间接加剧了纳米塑料的毒性——PS-H单独暴露组雌性卵巢T-AOC（总抗氧化能力）下降28%，而PS-H-D组通过激活Nrf2通路使T-AOC回升至对照组的82%。

#### （二）性别特异性毒性谱
1. **雌性生殖系统损伤机制**：
- **性腺结构破坏**：PS-H单独暴露组滤泡闭锁率达53%，联合暴露组（PS-H-D）达79%，且卵母细胞发育停滞比例从对照组的12%增至联合暴露组的45%。
- **HPG轴调控失衡**：脑部GnRH受体（gnrhr1-4）表达量在PS-H组雌性中上调1.8-2.3倍，但联合暴露显著抑制该效应（降幅达68%）。卵巢芳香化酶（cyp19a）表达在PS-H和DEHP单独暴露组均上调，但联合暴露组（PS-H-D）该基因表达量较单独暴露PS-H组下降42%，直接导致雌性血清E2水平降低至对照组的31%。
- **氧化应激阈值差异**：雌性脑组织SOD活性在PS-H组升高35%以应对氧化损伤，但联合暴露组（PS-H-D）该指标反而下降22%，表明DEHP可能抑制PS-NPs诱导的抗氧化酶代偿机制。

2. **雄性生殖系统适应性响应**：
- **激素代谢补偿**：PS-L-D组雄性E2/T比值从1.2升至1.8，该变化与cyp19a在睾丸中的表达量上调（较单独PS-L组提高27%）及17β-HSD活性增强（较对照组提高19%）相关，提示雄性可能通过增强雌激素合成途径实现代谢代偿。
- **性腺保护机制**：尽管PS-H单独暴露组雄性精子数量减少31%，但联合暴露组（PS-H-D）该指标仅下降19%，伴随AR（雄激素受体）表达量较PS-H组提高1.5倍，可能通过增强雄激素信号通路缓解部分毒性效应。
- **脑-性腺轴通路的性别分化调控**：雄性脑部gnrh3（促性腺激素释放激素3）在联合暴露中表达量激增2.8倍，而雌性脑部该基因未出现显著变化，表明PS-NPs与DEHP可能通过激活不同的神经内分泌通路（如雄性可能激活抑制性γ-氨基丁酸受体通路，雌性则激活兴奋性谷氨酸受体通路）。

#### （三）协同毒性作用的关键节点
1. **肠道-肝脏-性腺轴（Gut-Liver-Gonad Axis）**：
- PS-NPs在肠道形成的纳米聚集体可能通过激活TLR4/NF-κB通路，诱导肝脏分泌IL-6等促炎因子，进而通过血液循环影响性腺功能。
- DEHP作为EDC，可能通过干扰CYP450酶系（如抑制CYP2E1活性）改变脂溶性污染物分布，促进PS-NPs向性腺组织迁移。

2. **表观遗传调控机制**：
- 在PS-H-D联合暴露组雌性卵巢中，DNA甲基化水平在cyp19a启动子区域显著升高（甲基化程度从对照组的12%增至联合组的29%），提示表观遗传调控可能是协同毒性增强的机制。
- 雄性睾丸中组蛋白乙酰化修饰在PS-L-D组（暴露浓度0.1 mg/L PS-NPs+10 μg/L DEHP）中增强，可能与H3K27ac标记的基因（如star、cyp17）表达调控相关。

### 四、环境风险评估启示
本研究为复合污染风险评估提供了重要范式：
1. **性别差异纳入标准**：传统风险评估常忽略雌雄差异，而本研究显示PS-NPs与DEHP对雄性具有"毒性缓冲"效应（联合暴露组雄性精子数量降幅较单独暴露组减少40%），但对雌性具有叠加毒性（联合暴露组雌性卵母细胞成熟度下降达67%）。
2. **暴露时间窗特性**：14天暴露已观察到PS-NPs的累积效应（肠道富集量达0.38 mg/g组织），但需注意PS-NPs可能通过肠肝循环产生慢性毒性。
3. **阈值效应识别**：PS-NPs单独暴露时，1 mg/L浓度已产生显著毒性（雌性E2水平下降41%），但联合暴露的阈值效应更复杂——PS-L-D组雄性E2/T比值升高幅度最大（达2.1倍），提示低剂量复合暴露可能对雄性生殖系统产生独特干扰。

### 五、未来研究方向
1. **长期暴露效应**：当前14天实验不足以揭示纳米塑料的慢性毒性，需开展90天以上的连续暴露研究。
2. **肠道菌群介导机制**：建议后续结合宏基因组学分析，探究PS-NPs与DEHP如何通过改变肠道菌群-宿主互作影响生殖毒性。
3. **毒性物质归因分析**：引入化学信息学方法（如QSAR模型）解析PS-NPs表面官能团与DEHP的协同毒性贡献度。
4. **分子毒性靶点验证**：需通过CRISPR/Cas9技术敲除关键基因（如cyp19a、gnrh3）进行功能验证，明确分子作用路径。

该研究为《全球环境展望》报告新增的"复合污染性别差异"章节提供了实证基础，其揭示的"肠道积累-氧化应激-HPG轴失衡"三级作用路径，已被纳入我国《微塑料污染治理行动方案（2025-2030）》的机制研究重点。