自动磁性固相萃取辅助的高分辨率质谱技术的发展与应用：用于尿液样本中26种芬太尼及其代谢物的灵敏快速检测

《Journal of Chromatography A》：Development and application of automatic magnetic solid phase extraction assisted High-Resolution Mass Spectrometry for sensitive and rapid determination of 26 fentanyl and metabolites in urine samples

高效液相色谱-串联质谱法快速检测尿液中的26种芬太尼类似物及代谢物，自动化磁固相萃取技术减少预处理时间至30分钟，检出限低至0.01 ng/mL，方法验证显示良好线性（R2>0.99）和准确性（75.1%-117.0%）。

　　

李万利|王洋|于美香|张海|邓晓军

上海体育大学上海兴奋剂分析研究所，中国上海200438

摘要

在过去三十年中，由于非法使用芬太尼类似物导致的众多死亡事件引起了全球的关注。然而，由于样品预处理耗时费力、灵敏度低以及筛查效率有限，检测芬太尼化合物的微量水平仍然具有挑战性。在这项研究中，我们开发并验证了一种基于高效液相色谱-串联质谱（HPLC–MS/MS）的快速灵敏方法，用于同时测定尿样中的26种芬太尼类似物及其代谢物。经过自动磁固相萃取（auto-MSPE）后，分析物在C18柱上进行分离，并使用MRM HR模式进行检测。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.01至0.05 ng/mL和0.04至0.1 ng/mL。该方法仅需30分钟即可完成32个尿样的预处理，满足常规检测要求，同时实现了环保和经济的工作流程。在0.1–100 ng/mL的浓度范围内（两种化合物为0.5–100 ng/mL），所有分析物均表现出良好的线性，相关系数（R2 > 0.99）。准确度在75.1%至117.0%之间，提取回收率在72.1%至100%之间，基质效应在64.2%至111.7%之间。该方法成功应用于真实尿样中芬太尼及其主要代谢物诺氟芬太尼的检测和定量。这些结果展示了该方法在法医和临床毒理学中可靠检测芬太尼类似物的潜力。

部分内容

引言

芬太尼是一种合成的阿片受体激动剂，可选择性激活μ受体产生镇痛效果，其效力是吗啡的50-100倍[1]。芬太尼由一个哌啶环与N-苯基丙酰胺和苯乙基基团相连，基于此结构有五种常见的修饰位点（图1）。由于可以通过这些位点的修饰轻松合成芬太尼类似物，因此出现了越来越多结构多样的类似物。

化学品和试剂

所有芬太尼标准溶液，包括β-OH-硫芬太尼（CAS: 1474-34-6）、β-OH-芬太尼（CAS: 78995-10-5）、丙烯酰芬太尼（CAS: 82003-75-6）、阿芬太尼（CAS: 71195-58-9）、芬太尼（CAS: 437-38-7）、呋喃芬太尼（CAS: 101345-66-8）、异丁酰芬太尼（CAS: 119618-70-1）、4-氟异丁酰芬太尼（CAS: 244195-32-2）、乙酰-α-甲基芬太尼（CAS: 101860-00-8）、α-甲基芬太尼（CAS: 79704-88-4）、乙酰芬太尼（CAS: 3258-84-2）、诺苏芬太尼（CAS: 61086-18-8）、卡芬太尼（CAS: 59708-52-0）等。

方法验证

遵循广泛接受的方法验证框架[29]，对所有参数进行了全面评估，包括选择性、检测限（LOD）、定量限（LOQ）、线性范围、日内和日间准确度、精密度、提取回收率、基质效应、携带效应和稳定性。

色谱条件优化

一般来说，芬太尼类似物的分析方法必须解决异构体的分离问题，例如4-氟丁酰芬太尼和4-氟异丁酰芬太尼、丁酰芬太尼和异丁酰芬太尼。Angi等人[30]使用五种类型的柱子评估了20种类似芬太尼的化合物（包括6组异构体）的分离条件。C18、C8和T3柱子用于反相色谱（RPC）模式，而PFP和酰胺柱子则用于亲水相互作用色谱。

应用

验证完成后，该方法用于检测一名56岁女性癌症患者的尿样中的芬太尼及其代谢物。该患者于2024年7月使用芬太尼透皮贴片缓解疼痛。在用药后5小时、16小时、21小时和24小时收集尿样（50 mL），并分析其中的芬太尼代谢物及其动力学特征。取样后，尿样立即转移到实验室并冷冻在-40 °C直至分析。

结论

本研究开发并验证了一种简单、快速且稳健的LC-MS/MS方法，用于测定尿样中的26种芬太尼类似物及其代谢物。该方法采用了一种新的高灵敏度自动磁固相萃取技术（auto-MSPE），实现了对尿样中低浓度芬太尼的检测。与传统固相萃取（SPE）相比，新开发的auto-MSPE方法消除了操作者引起的误差，支持高通量样品分析，并具有出色的稳定性和环保优势。

作者贡献

李万利：撰写初稿、研究、方法学设计、方法验证、数据可视化。王洋：撰写、审稿与编辑、概念构思、数据管理、正式分析、方法验证。于美香：正式分析、研究、数据可视化。张海：撰写、审稿与编辑、数据管理、研究、监督。邓晓军：撰写、审稿与编辑、概念构思、数据管理、资源协调、监督。

资助

本研究得到了上海市教育委员会“人工智能促进科研范式改革与学科跨越计划”的资助。

伦理声明

整个研究（包括样品收集）得到了上海第一妇婴医院伦理委员会的批准，所有参与者均签署了书面知情同意书（KS24475）。

作者贡献声明

李万利：撰写初稿、数据可视化、方法验证、方法学设计、研究。王洋：撰写、审稿与编辑、方法验证、正式分析、数据管理、概念构思。于美香：数据可视化、研究、正式分析。张海：撰写、审稿与编辑、监督、研究、数据管理。邓晓军：撰写、审稿与编辑、资源协调、数据管理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。