可持续便携式CRISPR-Cas3诊断技术：高灵敏度猴痘病毒检测新突破

《npj Biosensing》：Sustainable and portable CRISPR-based diagnostics for high-sensitivity Mpox detection

为应对猴痘（Mpox）疫情中快速、精准诊断工具的迫切需求，研究人员开发了Kairo-CONAN平台。该技术基于CRISPR-Cas3系统，结合一次性暖手宝（Kairo）作为恒温热源和冻干试剂，实现了设备无关的高灵敏度检测。研究通过优化crRNA和探针设计，成功实现了对猴痘病毒Clade Ia、Ib和IIb的特异性检测，灵敏度达100 aM（约数十个病毒拷贝）。该平台为资源有限地区提供了可持续、低成本的现场诊断方案，符合G7“100天使命”框架，显著提升了全球突发公共卫生事件的应对能力。

　　

猴痘（Mpox）是由猴痘病毒（MPXV）引起的人畜共患疾病，传统流行于中非和西非地区。然而，自2022年起，猴痘在全球范围内迅速传播，被世界卫生组织（WHO）列为国际关注的公共卫生应急事件（PHEIC）。当前主流的PCR检测技术虽灵敏度高，但依赖实验室基础设施和稳定电力，难以在资源匮乏地区推广；而快速抗原检测虽便携，却存在灵敏度与特异性不足的缺陷。这一矛盾凸显了开发兼具高精度、便携性及环境适应性的诊断工具的紧迫性。

为解决上述挑战，日本东京大学的研究团队在《npj Biosensing》发表了题为“Sustainable and portable CRISPR-based diagnostics for high-sensitivity Mpox detection”的研究，提出了名为Kairo-CONAN的创新诊断平台。该平台基于CRISPR-Cas3系统，通过一次性暖手宝（Kairo）提供恒温（37°C）反应环境，并采用冻干试剂实现室温稳定存储，无需电力设备即可完成重组酶聚合酶扩增（RPA）和CRISPR检测。研究还设计了针对猴痘病毒不同分支（Clade Ia、Ib、IIb）的特异性crRNA，并优化了单链DNA探针序列，显著提升了检测灵敏度与特异性。

关键技术方法

研究通过杆状病毒-昆虫细胞系统表达并纯化Cas3蛋白及Cascade复合物（含Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas11蛋白），采用冻干技术（10%海藻糖缓冲液）稳定酶活性；利用RPA扩增靶标DNA，结合CRISPR-Cas3的侧切活性切割荧光标记或生物素化探针，通过横向流动试纸条或荧光信号读数实现检测；临床样本模拟实验使用猴痘病毒Zr-599（Clade Ia）和TKY220091（Clade IIb）基因组DNA。

研究结果

CRISPR-Cas3介导的猴痘病毒检测

研究团队通过体外组装Cascade复合物（ivCascade）与Cas3蛋白，针对美国疾控中心（CDC）推荐的猴痘病毒靶标序列设计crRNA。实验表明，CRISPR-Cas3系统在37°C下可特异性切割靶标DNA，结合RPA扩增后灵敏度达到100 aM（约数十个病毒拷贝）。

设备无关的核酸检测：Kairo暖手宝应用

通过将反应管置于一次性暖手宝中，RPA和CRISPR-Cas3反应均达到与温育箱相当的效果，且可在低温（4°C）环境下稳定工作。横向流动检测进一步证实了该方案的可行性。

冻干CRISPR-Cas3组分的室温稳定性

冻干Cas3及Cascade复合物在4°C储存一周后活性保持95%以上，室温下仍保留60%活性，显著优于液态储存。冻干混合物在30天内稳定性未显著下降，可直接复水使用。

探针优化提升检测灵敏度

通过筛选探针序列发现，5′端为嘧啶碱基（如CC、CA）的六碱基探针可显著增强Cas3的侧切活性，信噪比提升2.4倍。优化探针（如ATATAT）将RPA反应时间缩短至10分钟，CONAN反应仅需5分钟。

Kairo-CONAN的猴痘分支特异性检测

针对Clade Ia、Ib、IIb设计的crRNA可特异性识别对应分支病毒基因组，横向流动检测灵敏度达150 aM。平台在混合人源基因组背景下仍精准识别猴痘病毒，且冻干试剂与优化探针联用可在15分钟内完成检测。

结论与意义

Kairo-CONAN平台通过整合CRISPR-Cas3的高特异性、暖手宝的便携热源及冻干试剂的稳定性，突破了传统诊断技术对基础设施的依赖。其分支特异性检测能力可适配病毒变异趋势，而探针优化进一步缩短了检测时间。该技术不仅为猴痘疫情提供了现场解决方案，还可通过替换crRNA扩展至其他RNA或DNA病毒（如SARS-CoV-2）的检测，符合G7“100天使命”对快速响应工具的需求。未来通过临床样本验证及操作流程简化，有望成为全球公共卫生应急体系中的重要工具。