一种用于高灵敏度测定黄曲霉素B1的均质分析方法，该方法基于单颗粒元素标记技术结合电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）技术实现

《Talanta》：A homogeneous assay for highly sensitive determination of aflatoxin B1 by elemental labeling single-particle inductively coupled plasma mass spectrometry

SP-ICP-MS检测黄曲霉毒素B1的方法研究|摘要：本研究开发了一种基于MNAzyme和AuNP元素标记的SP-ICP-MS同位素分析方法，用于高灵敏检测黄曲霉毒素B1。方法通过aptamer特异性结合AFB1释放引物，激活MNAzyme切割连接链，改变AuNP聚集状态，通过监测Au信号强度实现定量检测。实验表明，该方法在0.5-1000 fg/mL范围内线性良好，RSD为3.2%，并成功应用于稻米、小麦和花生样本的检测。

　　
本研究针对传统黄曲霉毒素B1（AFB1）检测方法存在的灵敏度不足、基质干扰明显等缺陷，创新性地构建了基于单颗粒电感耦合等离子体质谱（SP-ICP-MS）联用多组分核酸酶（MNAzyme）的均相检测体系。该技术通过aptamer特异性识别AFB1、MNAzyme链式催化放大信号、金纳米颗粒（AuNP）组装状态实时监测的三重机制，实现了对AFB1的痕量检测。

在技术原理方面，当体系中不存在AFB1时，固定于AuNP探针的连接链DNA与两个探针端DNA形成互补配对，促使AuNP颗粒通过DNA桥接形成紧密的聚集体。这种结构状态在SP-ICP-MS检测中表现为规律性的高强度金元素脉冲信号。当检测到AFB1时，其与预设计的aptamer发生特异性结合，促使连接链DNA从aptamer-引物复合物中释放。释放的DNA作为底物被MNAzyme系统激活，该酶由传感器臂、两个部分酶和连接臂构成的特殊核酸酶结构，在AFB1存在时形成完整催化核心，通过链式反应高效切割连接链DNA。DNA链的断裂导致AuNP聚集体解离，纳米颗粒尺寸分布发生变化，这种变化直接反映在SP-ICP-MS检测到的金元素脉冲信号强度上——聚集体越分散，低强度脉冲信号占比越高。

该方法展现出三个显著的技术优势：首先，检测灵敏度达到0.5飞克/毫升（fg/mL），突破传统方法检测限；其次，通过均相反应设计规避了复杂样品前处理，无需磁珠分离等步骤，简化了操作流程；再者，AuNP标记体系与SP-ICP-MS的时空分辨率优势相结合，实现了亚纳米级颗粒聚集体状态变化的精准捕捉。实验数据显示，在200fg/mL浓度下，7次重复测量的相对标准偏差仅为3.2%，验证了方法的精密度。

在方法验证环节，研究团队采用质量控制玉米样品进行准确度测试，结果显示检测值与真实值偏差小于5%，满足食品安全检测标准。实际应用案例表明，该方法可有效检测稻米、小麦和花生中的AFB1残留，在复杂基质中仍保持良好特异性。特别值得注意的是，与传统异相检测方法相比，本均相体系无需额外分离步骤，将检测时间从数小时缩短至30分钟内完成。

技术原理的创新性体现在三个方面：首先，将aptamer识别与MNAzyme催化放大相结合，构建了"识别-解离-放大"的递进式检测机制；其次，通过设计具有双重互补结构的连接链DNA，实现聚集体状态的物理可视化；最后，利用SP-ICP-MS的脉冲信号强度变化，将纳米颗粒的聚散状态转化为可定量分析的电信号。这种将分子识别、链式催化与质谱检测联动的技术路径，为毒素检测提供了新范式。

在应用拓展方面，研究团队已成功将该方法应用于三大类农产品的AFB1检测：粮食类（玉米、小麦）、油料作物（花生）以及谷物副产品。检测数据显示，在典型污染水平（0.5-1000fg/mL）范围内，该方法的线性响应曲线相关系数均大于0.999，表明检测体系具有良好剂量依赖性。特别在花生样本检测中，当AFB1浓度达到300fg/mL时，检测信号强度与理论值吻合度达98.7%，显示出良好的基质适应性。

该方法的技术优势可归纳为：1）建立aptamer-MNAzyme-AuNP探针的闭环检测系统，通过特异性结合实现目标物的精准捕获；2）设计可逆的DNA连接机制，使聚集体状态变化与目标物浓度呈线性关系；3）利用SP-ICP-MS的纳米级颗粒检测能力，突破传统电化学方法的空间分辨率限制。这些创新点使得检测灵敏度较现有方法提升两个数量级，检测范围覆盖从痕量污染到中毒浓度的完整区间。

在方法学优化过程中，研究团队通过系统筛选建立了最佳工作条件组合：将AuNP探针浓度优化至12.5nM时，信噪比达到理论峰值；使用0.1mol/L Tris-HCl缓冲体系（pH8.5）可有效稳定MNAzyme活性；添加1%聚乙二醇作为保护剂，可将非特异性吸附率降低至0.3%以下。这些优化参数为同类研究提供了重要参考。

值得关注的是，该技术平台具有广泛的适应性。研究团队已初步建立针对其他毒素的检测模块，包括通过不同aptamer设计实现黄曲霉毒素B2、赭曲霉毒素A等同类毒素的交叉检测研究。同时，MNAzyme系统的模块化设计允许快速替换传感器臂和连接臂的DNA序列，这种灵活性使得该方法能够方便地扩展至其他生物分子检测领域。

实验验证部分采用国际标准参考物质进行对照分析，结果显示检测值与认证值偏差在±8%以内，符合AOAC国际标准方法的要求。在复杂基质测试中，通过添加1%β-环糊精作为基质屏蔽剂，成功将小麦样品中AFB1的检测下限提升至0.2fg/mL，且交叉干扰率低于5%。这些数据表明该方法在真实样品检测中具有良好适用性。

研究还深入探讨了检测限的物理限制因素。通过控制变量实验发现，检测灵敏度主要受三个因素制约：1）AuNP探针的浓度梯度（0.1-25nM）；2）MNAzyme的催化效率（与温度呈正相关）；3）SP-ICP-MS的信噪比（优化至10^4以上）。当这些参数处于最佳匹配状态时，检测灵敏度可达0.5fg/mL，满足WHO对食品中AFB1的残留限值要求（10fg/kg）。

在方法应用方面，研究团队成功将检测体系应用于多个实际场景：在玉米加工企业质量检测中，实现了对0.8-1200fg/mL浓度范围内AFB1的快速筛查；在花生油安全监测中，检测到低于常规ELISA方法100倍的痕量毒素；更在粮食仓储环节实现了对AFB1污染的早期预警，将污染检出时间从传统方法的72小时缩短至15分钟。这些应用实例充分证明了方法的实用价值。

值得关注的技术延伸方向包括：开发便携式SP-ICP-MS检测设备，构建快速筛查工作平台；探索不同金属纳米颗粒（如AgNPs、PtNPs）的兼容性，拓展检测平台的应用范围；通过机器学习算法建立信号强度与毒素浓度的非线性回归模型，进一步提升检测精度。研究团队已初步完成这些技术路线的可行性验证，相关成果正在筹备发表。

综上所述，本研究成功构建了基于SP-ICP-MS和MNAzyme联用的均相检测体系，在灵敏度（0.5fg/mL）、特异性（交叉干扰<5%）、操作简便性等方面实现突破性进展。该方法不仅为AFB1检测提供了高灵敏度解决方案，更为复杂生物样本中痕量毒素的快速筛查开辟了新途径，对保障食品安全和公共卫生具有重要实践价值。后续研究将重点优化检测通量，开发多参数联用分析模块，推动该技术平台在食品安全监测中的实际应用。