工业废水处理厂污泥宏基因组中新型家族VIII酯酶的发现及其对手性S-扁桃酸的高效立体选择性拆分研究

《Scientific Reports》：Discovery and characterization of an enantioselective family VIII esterase from effluent treatment plant sludge metagenome

本研究针对手性扁桃酸及其衍生物在制药和精细化工领域对高光学纯度产品的迫切需求，从工业废水处理厂(ETP)污泥宏基因组中成功筛选并鉴定出一种新型家族VIII酯酶EstN3。该酶在温和条件下(pH 8.5, 45°C)对短链pNP酯(C2-C6)表现出最高活性，并展现出对S-甲基扁桃酸卓越的对映选择性(对映体过量e.e. >96%，E值=93)，为绿色生物催化合成手性砌块提供了高效新工具。

　　

手性化合物，如同我们的左右手，虽然组成相同，但在三维空间中的排列方式却截然不同，这种差异可能导致它们在生物体内产生截然不同的生理活性。扁桃酸(Mandelic Acid)及其衍生物正是这样一类极具价值的手性化合物，它们是合成多种抗生素（如头孢曼多）、抗肥胖药物、抗血栓药物、抗肿瘤药物和非甾体抗炎药的关键手性砌块。然而，化学法合成手性化合物往往面临反应条件苛刻、需要使用昂贵且可能有毒的手性催化剂、产生大量废物以及光学纯度不高等挑战。相比之下，酶催化作为一种绿色、高效且具有高度立体选择性的生物催化方法，能够在温和条件下（中性pH、常温常压）实现手性分子的精准合成，避免了传统化学合成中的诸多弊端。

在众多酶类中，酯酶(Esterase)和脂肪酶(Lipase)因其能够催化酯键的水解和形成，并且在手性化合物的动力学拆分中表现出优异的对映选择性，而成为手性合成领域的研究热点。传统的酶发现策略依赖于对可培养微生物的筛选，但自然环境中超过99%的微生物是无法在实验室条件下培养的，这极大地限制了我们挖掘新型酶资源的能力。宏基因组学(Metagenomics)技术的出现打破了这一瓶颈，它允许研究人员直接从环境样本（如土壤、水体、污泥）中提取所有微生物的总DNA，并构建宏基因组文库，进而通过功能筛选或序列筛选的方法，发现来自未培养微生物的新颖酶基因。工业废水处理厂(Effluent Treatment Plant, ETP)的污泥是一个独特的微生物资源库，其中蕴藏着能够降解多种人工污染物（如农药）的微生物群落，这些微生物可能进化出了具有特殊催化能力的酶，但相关研究仍相对缺乏。

在此背景下，发表在《Scientific Reports》上的这项研究，报道了从一个农药公司工业ETP污泥的宏基因组文库中，通过功能筛选发现并鉴定了一个全新的、属于家族VIII酯酶的新型酯酶EstN3，并首次揭示了该家族酶对S-扁桃酸甲基酯的高效立体选择性水解能力。

为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键技术方法：首先，从工业ETP污泥样本中提取宏基因组DNA，并构建了其质粒文库；其次，通过以三丁酸甘油酯为底物的功能筛选，从文库中筛选出具有酯解活性的克隆；接着，利用生物信息学工具对阳性克隆中的酯酶基因进行序列分析、 motifs（模体）鉴定和系统发育分析，以确定其分类学归属和特征；然后，通过原核表达系统（大肠杆菌BL21(DE3)）重组表达该酯酶，并利用镍柱亲和层析进行纯化；最后，对纯化后的EstN3进行了全面的生化性质表征，包括底物特异性、最适温度与pH、动力学参数、抑制剂和金属离子效应、有机溶剂耐受性，并重点评估了其对rac-甲基扁桃酸的对映选择性水解能力。

序列分析揭示EstN3属于家族VIII酯酶

通过对阳性克隆的DNA测序和序列分析，发现EstN3基因编码一个410个氨基酸的蛋白质，预测分子量约为45 kDa。其氨基酸序列与来自苯基杆菌属(Phenylobacterium)和柄杆菌属(Caulobacter)的未表征丝氨酸水解酶具有高度相似性（>83%）。更重要的是，EstN3的序列中包含家族VIII酯酶和C类β-内酰胺酶(Class C β-lactamases)特有的保守模体，包括SxxK（此处为S⁷²MTK）、YSx（Y¹⁹⁴S¹⁹⁵L）、WGG（W³⁶⁴G³⁶⁵G，对应于KTG模体的变体）、PLGMxDTxF、LxxxPGxxW和GGxG。这些模体的存在，特别是缺乏经典酯酶/脂肪酶的GxSxG模体而含有SxxK模体，强烈支持EstN3被归类为家族VIII酯酶。系统发育分析也证实EstN3与已知的家族VIII成员聚类在一起。

EstN3的生化特性表征

研究人员对纯化后的EstN3进行了详细的生化性质分析。底物特异性实验表明，EstN3偏好水解短链对硝基苯酯(pNP ester)，对pNP-戊酸酯(C5)活性最高，对碳链长度大于C6的底物活性显著降低（低于10%），这符合典型酯酶的特征。EstN3在最适温度45°C和最适pH 8.5条件下表现出最高酶活，并且在20°C至60°C的宽温度范围以及pH 7.0至10.0的碱性范围内仍保持较高活性，表明其是一种中温、偏碱性的酯酶。动力学分析显示，EstN3对pNP-戊酸酯的K_m值为1524 μM，V_max为386.1 μM/min/mg，催化效率(K_cat/K_m)为0.033 s^-1·μM^-1。抑制剂实验发现，EstN3的活性被丝氨酸水解酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)和二乙基焦碳酸酯(DEPC)强烈抑制，这与其推测的以SxxK模体中丝氨酸为催化亲核试剂的机制一致。金属离子实验中，Cu²⁺和Fe²⁺对酶活有强烈抑制作用，而Ca²⁺、Mg²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺影响不大。在有机溶剂耐受性方面，EstN3在10% (v/v)浓度的乙醇、异丙醇和二甲基亚砜(DMSO)中活性略有增强，在乙腈、丙酮中活性保持较好，而在二甲基甲酰胺(DMF)中活性下降至60%。

EstN3展现卓越的对映选择性

本研究最引人注目的发现是EstN3对手性底物的立体选择性。研究人员测试了EstN3对外消旋甲基扁桃酸(rac-methyl mandelate)的水解能力。高效液相色谱(HPLC)手性分析结果显示，EstN3能够高度选择性地水解(S)-对映体，产生(S)-扁桃酸。在转化率达到37%时，产物的对映体过量值(enantiomeric excess, e.e.)高达96.26%，其立体选择性常数(E值)为93，表明EstN3具有极高的(S)-对映体偏好性。这意味着EstN3可以用于从外消旋混合物中富集光学纯的(S)-扁桃酸或其衍生物。

讨论与意义

综上所述，本研究首次从工业ETP污泥宏基因组中成功挖掘并鉴定了一个新型家族VIII酯酶EstN3。该酶不仅具有中温、偏碱性、短链底物偏好性等生化特性，更重要的是，它展现出了对S-甲基扁桃酸前所未有的高对映选择性。家族VIII酯酶是一类相对研究较少的酯酶，其催化机制与经典的丝氨酸水解酶不同，通常与β-内酰胺酶相关。此前仅有少数家族VIII酯酶被报道具有手性选择性，且其底物多为其他结构类型（如(S)-甲基-3-羟基-2-甲基丙酸酯），EstN3是首个被报道对扁桃酸衍生物具有高立体选择性的家族VIII酯酶。

这项研究的发现具有多重重要意义：首先，它再次证明了宏基因组学是发现具有新颖功能和优良特性酶分子的强大工具，特别是像ETP污泥这样富含特殊降解微生物但尚未被充分探索的环境，是发现工业应用潜力巨大的新型生物催化剂的宝贵资源库。其次，EstN3的发现为手性扁桃酸及其衍生物的绿色合成提供了一种极具潜力的生物催化剂。与传统的需要有机溶剂的转酯化反应相比，EstN3催化的水解反应在水相中进行，更加环境友好，且其高立体选择性保证了产物的高光学纯度。最后，对EstN3的深入研究不仅拓展了我们对家族VIII酯酶催化多样性的认识，也为进一步通过蛋白质工程改造该家族酶、优化其催化性能以适应工业化生产需求奠定了基础。这项研究体现了从“废物”到“资源”的转化理念，为生物制造和绿色化学的发展贡献了新的酶资源。