RAD51 D-loop结构揭示真核生物链交换机制：从DNA弯曲到碱基对打开的逐步过程

《Nature Communications》：RAD51 D-loop structures reveal the mechanism of eukaryotic RAD51-mediated strand exchange

本研究针对真核生物同源重组中RAD51介导的链交换机制不明确的问题，通过冷冻电镜技术捕获了五个关键中间体结构，结合分子动力学模拟，揭示了由N端结构域(NTD)引导的DNA逐步弯曲、L2环插入促进链分离以及S2位点稳定产物的空间协同机制，为理解DNA修复提供了重要结构基础。

　　

当DNA双链断裂这种致命损伤出现在细胞中时，同源重组（Homologous Recombination, HR）便扮演起基因组"修复师"的关键角色。在这一精密修复过程中，RAD51重组酶介导的链交换（strand exchange）反应是核心步骤：RAD51首先在单链DNA（ssDNA）上形成称为突触前纤丝（presynaptic filament）的螺旋结构，然后寻找同源的双链DNA（dsDNA），并催化入侵单链与互补链配对，形成经典的D-loop结构。然而，真核生物RAD51究竟如何巧妙地解开坚硬的DNA双螺旋，并实现精确的链交换，这一分子机制长期以来是领域内悬而未决的谜题。

与原核生物RecA不同，RAD51缺乏负责招募dsDNA的C端结构域（CTD），取而代之的是一个进化上保守的66个残基的N端结构域（NTD）。尽管生化研究表明NTD参与dsDNA结合，但其如何与距离较远的L2环（loop L2）协同作用来 destabilize（ destabilize）同源dsDNA，一直缺乏直接的结构证据。传统的螺旋重建冷冻电镜技术虽然成功解析了RAD51突触前和突触后纤丝的整体结构，但由于D-loop的形成只发生在特定的原体（protomer）上，破坏了螺旋对称性，使得对称平均方法无法捕捉到D-loop形成的动态细节。

为了攻克这一难题，来自中央研究院和台湾大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们巧妙地利用RAD51-SEAD（S208E/A209D）双突变体，该突变体保留了野生型的纤丝形成和链交换活性，但在冷冻电镜样品制备的短时间内倾向于形成包含约9个原体的迷你纤丝（mini-filament），从而绕过了长纤丝对单颗粒分析的制约。研究人员设计了多种含有部分错配"气泡"（bubble）的dsDNA底物，成功地捕获了从dsDNA招募到D-loop形成的五个关键中间态结构，分辨率最高达2.91 ?。结合分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟，他们首次清晰地描绘了RAD51介导链交换的逐步机制。

本研究主要运用了以下几种关键技术方法：研究人员利用小鼠RAD51-SEAD突变体在体外组装与ssDNA和dsDNA结合的迷你纤丝，通过冷冻电镜单颗粒分析技术解析了多个复合物结构。他们设计了系列含有不同长度错配区的DNA底物以捕获反应中间体，并进行了全原子分子动力学模拟以动态追踪DNA构象变化。此外，还通过基于结构的点突变（如P83G, K284A, R306A）结合电泳迁移率变动分析（EMSA）和链交换/D-loop形成实验，验证了关键结构域的功能。

RAD51迷你纤丝的结构特征

研究首先证实，RAD51-SEAD突变体形成的迷你纤丝在结构上与通过螺旋重建解析的野生型RAD51长纤丝高度一致（均方根偏差RMSD分别为0.93 ?和1.04 ?），并且其体外链交换活性与野生型相当。这为后续基于迷你纤丝的结构研究提供了可靠基础。

捕获链交换的五个关键中间体

通过系统测试二十多种含有不同错配气泡的dsDNA底物，研究人员成功解析了五个代表不同反应阶段的冷冻电镜结构：

1. 1.
   4-bp错配复合物（分辨率4.53 ?）：展示了dsDNA通过两个相邻NTD（N+1, N+2）非特异性结合的早期招募状态，dsDNA尚未弯曲。
2. 2.
   8-bp错配复合物（分辨率3.23 ?）：dsDNA呈现明显弯曲，与四个相邻NTD（N+1至N+4）相互作用，代表了dsDNA被招募后的构象变化。
3. 3.
   8-bp错配（靠近5'端）D-loop复合物（分辨率3.91 ?）：首次观察到清晰的异源双链（heteroduplex）形成，涉及5'端1又1/3个碱基对三联体（base-pair triplet）的配对。
4. 4.
   8-bp错配（靠近3'端）D-loop复合物（分辨率3.2 ?）：异源双链配对扩展至2又2/3个三联体。
5. 5.
   12-bp错配D-loop复合物（分辨率3.42 ?）：异源双链进一步扩展，涉及1/3-3-2/3个三联体，跨越五个原体。

分子动力学模拟将这些静态结构串联成一个动态过程，揭示了反应的时间序列。

D-loop形成的结构基础

对8-bp错配（靠近5'端）D-loop复合物的高分辨率结构分析揭示了精细的分子相互作用：

• •
  NTD引导DNA弯曲：dsDNA与NTD^N+1、NTD^N+2和NTD^N+4上的Lys64和Lys70结合，向位于原体N+5的链交换位点（site I）弯曲。这种结合导致NTD^N+1相对于未结合状态旋转了6.4°。
• •
  L2环插入防止重退火：来自L2环的疏水残基Met278^N+6、Phe279^N+6、Met278^N+7和Phe279^N+7插入到新分离的链之间，物理上阻止了dsDNA的重新退火（reannealing）。
• •
  S2位点稳定置换链：带正电荷的S2位点（site II）残基，包括Arg306^N+7、Lys304^N+7、Arg303^N+7、Arg130^N+7和Lys284^N+6，通过静电相互作用稳定被置换的链（displaced strand）。
• •
  Arg235的构象变化：通常用于划分碱基对三联体的Arg235^N+6在此处向外旋转，与新分离的互补链相互作用，提示其除了划分单元外，还可能引导互补链走向交换位点。

D-loop的延伸与配对传播

通过分析靠近3'端的8-bp和12-bp错配D-loop结构，研究人员观察到了异源双链沿纤丝轴（从3'端向5'端）的传播过程。在12-bp错配复合物中，12个核苷酸（5'-G19-G30）在原体N+3至N+7的site I处形成了异源双链。同样观察到L2环残基的插入、S2位点对置换链的稳定，以及在链分离点附近的π-π堆叠（如Phe279^N+7与核苷酸T19）和静电相互作用。比较不同中间体发现，Arg235的构象以及3'倾斜双链（3'-tilted duplex）与NTD的接触方式存在可变性，表明局部重排以调节配对传播。研究还确认，8个核苷酸（8-nt）的微同源性（microhomology）是稳定D-loop形成的最小单位，短于此时互补链无法形成稳定的异源双链。

分子动力学模拟揭示碱基对打开的动态过程

MD模拟为冷冻电镜观察到的静态图像提供了动态验证：

• •
  D-loop起始：模拟显示，被NTD^N+1和NTD^N+2招募的B型dsDNA会被吸引向靠近ssDNA结合位点的带正电荷通道，并与NTD^N+3相互作用，导致dsDNA轻微弯曲（约170°）。随后，3'倾斜双链与带正电荷的L2环^N+7和Arg303-Arg306环^N+7发生瞬时相互作用，使弯曲加剧至约140°，并导致第一个碱基对在L2环附近打开。之后，3'倾斜双链由于空间限制绕过NTD^N+4，与NTD^N+5结合，角度偏转约120°，这与图2c观察到的构象高度吻合。
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  D-loop传播：模拟以图2d结构为起点，将3'倾斜双链改为更稳定的G:C碱基对。模拟显示，3'倾斜双链从NTD^N+4解离，并向上平移9.7°。与L2环^N+7和Arg303-Arg306环^N+7/N+8的带正电荷区域结合，使得互补链接近site I^N+6，导致G31碱基对断裂。这表明链交换通过从结合的NTD解离和与Arg303-Arg306环结合这一重复机制逐步向下一个原体传播。

基于结构突变体的功能验证

为了验证NTD、L2环和Arg303-Arg306片段的功能，研究人员构建了P83G（扰动NTD运动）、K284A（影响L2环正电性）和R306A（影响S2位点）突变体。虽然这些突变对ssDNA结合亲和力影响较小，但在DNA饱和结合条件下，它们均表现出持续的链交换活性降低。更重要的是，当使用完全同源的dsDNA底物时，突变体的活性缺陷明显，而使用含有12-bp错配气泡（预分离）的dsDNA底物时，其活性可被部分挽救（约增加50%），而野生型活性变化不大。这有力地证明了NTD、L2环和Arg303-Arg306片段在链分离过程中的特异性作用。

讨论与结论

本研究通过解析RAD51介导链交换途径中的五个关键中间体结构，并结合分子动力学模拟，提出了一个空间和时间上协同的逐步机制模型。该模型的核心在于：保守的NTD负责招募并弯曲dsDNA；dsDNA的弯曲引入局部机械应变， destabilize 碱基配对；随后，带正电荷的L2环和Arg303-Arg306区域进一步诱导弯曲和局部碱基对打开；L2环的疏水残基（Met278/Phe279）插入分离的链间防止重退火；同时，S2位点捕获并稳定置换链，从而将互补链递送到链交换位点进行同源配对。

与RecA机制相比，RAD51的独特之处在于：RecA的CTD结合dsDNA后与L2环产生空间冲突，直接导致L2插入和链打开。而在RAD51中，NTD首先从3'倾斜双链解离，使dsDNA重新定位至L2环和Arg303-Arg306的正电表面，进而诱导弯曲和链打开。尽管域的使用不同，但RAD51和RecA的D-loop几何结构，特别是5'倾斜双链附近，惊人地保守。主要区别在于3'倾斜双链部分，RAD51中的3'倾斜双链比RecA多了一个约60°的外向扭转，导致其与RAD51 N+3原体的NTD相互作用，而RecA中与N+4原体的CTD相互作用。

研究还明确证实了链交换沿入侵ssDNA的3'到5'方向进行，这与许多生化研究结论一致，但与近期另一项基于人RAD51 D-loop冷冻电镜结构研究提出的5'到3'极性相反，表明仍需进一步的实验验证。

总之，这项研究首次提供了真核生物RAD51介导链交换的连续动态结构视图，详细阐明了从dsDNA招募、弯曲、碱基对 destabilize、链分离到置换链稳定的全过程。这些发现不仅深化了对同源重组分子机制的理解，也为研究与DNA修复缺陷相关的疾病（如癌症）以及开发相关治疗策略提供了重要的结构基础。