氟化卟啉探针一步法标记实现活细胞硫醇蛋白质组的原位成像与谱图分析

《The Innovation》：One-step labeling with a fluorinated porphyrin-based probe enables in situ imaging and profiling of the thiol proteome

本刊推荐：研究人员针对活细胞硫醇蛋白质组分析中缺乏能够直接整合荧光成像与化学蛋白质组学的多功能探针这一挑战，开发了基于氟化卟啉的荧光、可富集且质谱兼容的FP探针。该探针通过一步标记实现了细胞内硫醇蛋白的原位可视化及基于质谱的可靠位点鉴定，并建立了可视化引导蛋白质组学（VGP）工作流程，显著提升了低溶剂可及性半胱氨酸残基的捕获能力，为靶点识别和药物发现提供了重要工具。

　　

在生命活动的精密调控网络中，蛋白质的半胱氨酸（Cysteine）残基扮演着至关重要的角色，它们是细胞氧化还原稳态的核心调节因子。这些带有巯基（-SH）的氨基酸残基如同蛋白质分子上的“敏感开关”，其化学状态的细微变化能够影响蛋白质的结构、功能及其参与的众多生物学过程，从能量代谢到细胞信号转导。全面解析硫醇蛋白质组（thiol proteome），即细胞内所有功能性半胱氨酸的集合，不仅有助于识别关键的半胱氨酸位点，更能为理解肿瘤发生、病毒致病机制以及阿尔茨海默病等神经退行性疾病提供关键线索。然而，如何在活细胞环境中同时对硫醇蛋白质组进行实时可视化和精准的蛋白质组学分析，一直是一个巨大的科学难题。传统的化学标签，如同位素编码亲和标签（ICATs）和半胱氨酸反应性磷酸盐标签（CPTs），虽然能够在一定规模上分析半胱氨酸的动态变化，但它们无法提供可视化信息，并且需要裂解细胞，这不可避免地改变了蛋白质和半胱氨酸的原始状态。尽管点击化学（click chemistry）技术的发展使得通过后续反应分别安装荧光或亲和模块成为可能，但这种多步骤过程增加了样品损失和污染的风险，难以实现成像数据与蛋白质组数据的无缝整合。此外，整个富集过程无法被肉眼观察，使得对富集效率的评估存在盲区。

为了攻克这一瓶颈，复旦大学陆豪健教授团队的研究人员将目光投向了构建一种集荧光、可富集性和质谱（MS）兼容性于一体的新型化学探针。他们巧妙地将荧光特性整合到氟化标签中，利用被称为“生命色素”的卟啉（porphyrin）其固有的荧光特性和可见颜色，设计并合成了一种基于氟化卟啉（fluorinated porphyrin, FP）的多功能探针（FP探针）。这项发表于《The Innovation》的研究，展示了一种名为FP-MBA的探针如何通过一步标记，实现活细胞硫醇蛋白质组的原位成像、可视化富集及高可靠性位点鉴定，从而建立了一套名为可视化引导蛋白质组学（visualization-guided proteomics, VGP）的全新工作流程。

研究人员为开展此项研究，主要运用了以下几项关键技术：基于氟化卟啉结构的化学探针设计与合成；利用该探针进行活细胞硫醇蛋白质组的一步法标记与共聚焦荧光显微镜成像；建立基于C18柱富集和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的可视化引导蛋白质组学（VGP）分析流程，用于标记肽段的特异性富集和鉴定；以及应用生物信息学方法（如溶剂可及表面积SASA分析、功能富集分析等）对鉴定到的半胱氨酸位点进行结构和功能特征挖掘。研究中所用的细胞样本为HeLa细胞（人宫颈癌细胞系）和HEK293T细胞（人胚胎肾细胞系）。

设计与验证多功能FP探针

研究团队设计并合成了两种FP探针（FP-MBA和FP-MA），其中马来酰亚胺（maleimide, MA）作为高反应活性和选择性的巯基反应基团，而四（五氟苯基）卟啉则作为可视化模块。体外实验首先以牛血清白蛋白（BSA）为模型蛋白验证了探针的反应性，结果显示FP-MBA具有更高的标记效率，并能通过凝胶内荧光观察标记导致的蛋白条带迁移。更重要的是，研究团队发现FP探针标记后的肽段疏水性发生显著改变，从而可以利用简单的C18柱实现高效富集，并且整个富集过程可以通过荧光信号进行直观监测，这是该技术的一大亮点。

建立VGP工作流程并应用于细胞硫醇蛋白质组分析

基于FP-MBA探针的特性，研究人员建立了VGP工作流程。将该探针应用于活HeLa细胞后，成功实现了细胞内硫醇蛋白的原位荧光成像，并且信号亮度呈浓度依赖性增强。通过半胱氨酸封闭实验（使用N-乙基马来酰亚胺NEM）证实了标记的特异性。后续的LC-MS/MS分析表明，FP-MBA能够选择性标记半胱氨酸残基，富集特异性高达87.2%，并且约97.7%的FP-MBA修饰肽段的质谱图谱中都能观察到探针衍生的特征离子（m/z 1197.13），证明了其在细胞环境中工作的可靠性。最终，在基础状态的细胞中，从三次重复实验中共鉴定到2016个半胱氨酸位点。

鉴定半胱氨酸的生物信息学分析

对鉴定到的半胱氨酸进行深入分析揭示了FP-MBA探针的独特优势。溶剂可及表面积（SASA）分析显示，高达75.8%的被标记位点属于低溶剂可及性区域（相对溶剂可及面积 < 20%），这与传统炔烃探针（如IAAyne）主要标记溶剂暴露位点形成鲜明对比。功能域富集分析发现，被标记的半胱氨酸显著富集于RNA识别、解旋酶和GTP酶蛋白家族、二硫键功能域以及importin N端域等关键功能区域。此外，28.5%的被标记半胱氨酸被注释为可配体（ligandable）位点，约为人类半胱氨酸数据库中基线比例（14.7%）的两倍，表明该探针在发现功能性位点方面潜力巨大。

VGP工作流程在氧化应激细胞中的验证与应用

为了展示FP-MBA在复杂生物学过程中的应用价值，研究人员利用硫醇氧化剂二酰胺（diamide）处理HeLa细胞诱导氧化应激。荧光成像显示，与基础状态细胞相比，二酰胺处理细胞的FP-MBA信号强度显著降低，直观反映了氧化应激导致的蛋白巯基反应性下降。通过VGP工作流程，在氧化应激细胞中鉴定到2068个FP-MBA修饰的半胱氨酸位点。无标记定量（LFQ）分析揭示了119个显著下调的半胱氨酸（氧化应激下反应性降低）和71个显著上调的半胱氨酸。主成分分析（PCA）清晰地将基础状态和氧化应激状态的样本区分开来。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析表明，下调的半胱氨酸主要与细胞氨基酸代谢、二羧酸代谢、碳代谢和TCA循环等核内及基础代谢过程相关，而上调的半胱氨酸则与RNA剪接、核质转运和谷胱甘肽代谢等氧化应激响应通路有关。

挖掘受调控的半胱氨酸位点

深入分析发现，75.3%的上调半胱氨酸位点具有低溶剂可及性，且约38%被注释为可配体位点，进一步凸显了FP-MBA探测功能重要但难以接近的半胱氨酸位点的能力。研究特别关注了AP2B1蛋白的Cys818位点，该位点在二酰胺应激下显著下调，且其相对溶剂可及面积值极低（0.02）。结构分析表明，Cys818位于AP2B1的β-appendage结构域，与EPS15和CLTC（Clathrin heavy chain）等相互作用蛋白的界面相邻。为了验证氧化应激是否增强了AP2B1与这些伙伴蛋白的相互作用，从而“遮蔽”了Cys818导致其标记减少，研究人员在HEK293T细胞中进行了FLAG标签标记的AP2B1的共免疫沉淀（co-IP）实验。LFQ和Western blot结果均证实，在二酰胺处理下，AP2B1与CLTC和EPS15的相互作用确实增强了。这一发现揭示了AP2B1的Cys818是一个对氧化应激诱导的蛋白质相互作用变化敏感的埋藏位点，为理解相关疾病的生物学过程提供了新视角。

研究结论与意义

本研究成功设计并验证了一种新型的氟化卟啉基探针FP-MBA，它通过一步标记即可无缝整合荧光成像与化学蛋白质组学，用于全面的硫醇蛋白质组分析。其所建立的VGP工作流程，使得在活细胞中原位可视化硫醇蛋白质组、监测富集过程并进行可靠的位点鉴定成为现实。应用该技术，研究人员不仅能够通过荧光成像区分不同的细胞状态，还能在蛋白质组水平深入解析半胱氨酸的动态变化。尤为重要的是，FP-MBA展现出对埋藏半胱氨酸的独特标记能力，发现并验证了AP2B1蛋白上极难接近的Cys818位点对二酰胺应激诱导的蛋白质相互作用变化敏感。这项工作不仅显著推进了硫醇蛋白质组的分析技术，其将荧光成像与质谱蛋白质组学整合的策略，也为未来设计针对其他氨基酸残基（如赖氨酸）的荧光-质谱双功能探针提供了范本，在药物发现、靶点识别和疾病诊断等领域具有广阔的应用前景。