NUTCRACKER调控水稻根尖分生组织皮层细胞分裂与干细胞微环境稳态的机制研究

《Journal of Experimental Botany》：NUTCRACKER orchestrates cortical cell divisions and sustains stem cell niche integrity in the rice root meristem

本研究针对水稻根尖分生组织中细胞分裂调控机制不清的问题，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建OsBIRD/IDD家族基因突变体，发现OsNUC通过与OsSHR1、OsSCR1形成蛋白复合物，调控OsQHB/WOX5表达，从而维持静止中心（QC）特性并限制皮层细胞分裂。该研究揭示了单子叶植物中BIRD蛋白功能的新机制，为作物根系改良提供了理论依据。

　　

在多细胞生物发育过程中，细胞命运决定和组织特化由形态发生素梯度和转录因子网络共同驱动。植物与动物相似，转录因子网络的时空动态调控着发育过程中的组织模式建立。在根尖分生组织中，不同细胞列的精确组织和组织类型间边界的建立对根系正常生长至关重要。根尖分生组织是活跃分裂细胞的储备库，负责维持根系的纵向生长，而分生组织功能异常的突变体会发育出根系异常且生长受阻的表型。分生组织包含干细胞微环境，所有组织类型均通过形成性分裂产生。干细胞位于根尖，围绕组织中心（即静止中心，QC）排列。QC细胞具有低有丝分裂活性，对干细胞维持至关重要。根系干细胞最典型的例子是皮层-内皮层起始细胞，其通过不对称分裂产生构成皮层组织的皮层和内皮层。该过程由SCARECROW（SCR）、SHORT-ROOT（SHR）和INDETERMINATE DOMAIN（IDD，亦称BIRD）蛋白的相互作用控制。

在拟南芥中，SHR在维管组织中表达并促进SCR表达。SCR与BIRD蛋白JACKDAW（JKD）和BALDIBIS（BIB）共同将SHR保留在细胞核内阻止其进一步移动。BIRD蛋白JKD在QC和皮层组织中表达，并与SCR和SHR结合。SCR、SHR和JKD激活CYCLIN D6（CYCD6）表达诱导垂周分裂，从而导致皮层和内皮层分离。jkd突变体根系显示源自皮层的异常分裂，无法维持功能性QC，远端柱状干细胞分化，而JKD在QC特异性启动子WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX5（WOX5）驱动下的异位表达诱导QC分裂。

尽管SHR/SCR通路在指定QC、内皮层和皮层方面的功能在植物物种间似乎保守，但其实现最终组织结构的调控机制必然因物种而异。例如，水稻的皮层-内皮层起始细胞产生单层内皮层和复层皮层，这与拟南芥的模式不同。BIRD蛋白在其他物种根系发育中是否发挥类似作用仍是未解之谜。

本研究旨在阐明BIRD/IDD蛋白在水稻根系中的功能。研究人员通过CRISPR/Cas9技术靶向水稻BIRD/IDD编码基因（OsMGP、OsNUC、OsJKD、OsSTR、OsRVN），获得纯合突变体。结果显示，Osnuc突变体根尖分生组织出现皮层和维管组织异位分裂、QC静止性丧失以及柱状干细胞提前分化等表型。进一步研究发现OsNUC与OsSHR1和OsSCR1互作，并调控OsSCR和OsQHB/WOX5的表达。OsNUC在皮层组织、内皮层初始细胞、内层皮层和外皮层中表达，其原生启动子驱动的OsNUC-YFP能回补Osnuc突变体表型。

这些发现揭示了BIRD蛋白OsNUC通过控制细胞分裂和维持干细胞微环境，在水稻根尖分生组织发育中发挥关键作用。该研究不仅拓展了对单子叶植物根系发育调控机制的认识，也为通过遗传改良优化作物根系构型提供了新靶点。论文发表于《Journal of Experimental Botany》，为植物发育生物学领域提供了重要理论依据。

关键技术方法包括：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻BIRD基因突变体；通过振动切片术、钙白染色、mPS-PI染色等进行组织学分析；采用杂交链式反应荧光原位杂交（HCR RNA FISH）检测基因表达空间分布；运用双分子荧光互补（BiFC）和酵母双杂交（Y2H）验证蛋白互作；构建OsNUCpro>>OsNUC-YFP翻译报告基因进行功能回补实验。

OsNUC缺失导致根尖分生组织细胞分裂异常

通过比较不同BIRD基因突变体的根系表型，发现Osnuc突变体在根长方面与野生型无显著差异，但其根尖分生组织细胞分裂方向紊乱，干细胞微区域结构破坏。显微观察显示突变体QC位置出现异常分裂，柱状干细胞中淀粉颗粒积累，表明干细胞提前分化。

OsNUC通过调控QC分裂维持干细胞微环境

EdU标记实验证实Osnuc突变体QC细胞分裂频率显著高于野生型。HCR RNA FISH分析显示OsQHB/WOX5在突变体QC区域表达缺失，而在中柱鞘表达正常，表明OsNUC特异性调控QC功能的分子基础。

OsNUC限制皮层细胞分裂并稳定组织边界

根横切面分析发现Osnuc突变体皮层细胞层数增加，维管组织细胞增殖异常。虽然OsSHR1表达模式未变，但OsSCR在邻近内皮层的皮层细胞中表达增强，提示OsNUC通过调控SCR限制皮层细胞过度分裂。

OsNUC表达模式与蛋白互作网络

OsNUC转录本在皮层-内皮层起始细胞、内皮层、内层皮层和外皮层中检测到，而其蛋白在QC也有定位。功能回补实验证实OsNUC-YFP能完全恢复突变体表型。BiFC和Y2H实验证明OsNUC与OsSHR1、OsSCR1直接互作，表明三者形成保守的调控复合物。

本研究系统阐明了OsNUC在水稻根尖分生组织发育中的核心作用：通过与OsSHR1/OsSCR1形成蛋白复合物，调控OsQHB/WOX5表达维持QC特性，同时限制皮层细胞过度分裂。该发现不仅揭示了单子叶植物中BIRD蛋白功能的新机制，还提示水稻中BIRD蛋白功能可能发生进化分歧——OsNUC承担了拟南芥JKD的功能。研究还探讨了其他BIRD基因可能在水稻根系发育中发挥冗余作用或参与环境应答调控的可能性。

该研究的重要意义在于：首次在单子叶植物中验证了BIRD蛋白在根系发育中的保守性与特异性，为理解SHR/SCR/BIRD模块的进化提供了新视角；阐明了OsNUC通过调控QC分裂和皮层组织模式影响根系发育的分子机制，为作物根系遗传改良提供了潜在靶点；建立的实验体系为后续研究禾本科植物根系发育奠定了方法学基础。这些发现对提高作物抗逆性和养分吸收效率具有重要理论指导价值。