揭示银鲤（Parvalbumin）在酵母中的一种新型冷冻保护作用：提高抗冻融能力背后的多重机制

《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Unveiling a novel cryoprotective role of silver carp parvalbumin in yeast: Multifaceted mechanisms underlying enhanced freeze-thaw tolerance

银鱼球蛋白显著提升酵母冻融耐受性，其机制包括热滞留（0.72℃）、抑制冰晶重结晶及减少胞内冰形成，同时通过调控SLT2、FKS1等基因及稳定Mpk1等关键蛋白功能发挥作用。

　　

袁成志|唐彦峰|何志刚|李向红|黄一群|刘永乐|王发祥

中国湖南省水产食品资源加工工程技术研究中心，长沙理工大学食品科学与生物工程学院，长沙410114

摘要

本研究采用实验测定、转录组学和计算模拟相结合的综合方法，探讨了银鱼小清蛋白（ScPV）对提高酵母耐冻性的作用及相关机制。经过2次冻融循环后，ScPV处理过的酵母表现出显著更高的存活率和生存率（24.0% vs 0.5%），线粒体膜电位也提高了3倍。进一步分析表明，ScPV具有0.72°C的热滞后活性，并能强烈抑制冰晶重结晶。它还减少了细胞内冰的形成，并将酵母悬浮液的冰形成温度从-9.9°C降低到-14.7°C。超微结构观察表明，ScPV可能减轻冻融引起的损伤，并有助于维持细胞壁和膜的完整性。此外，转录组学分析显示，ScPV调节了关键基因（如SLT2、FKS1）的转录，这些基因与细胞壁强化和修复相关的应激反应途径有关。分子对接和动力学模拟表明，ScPV与Mpk1等关键蛋白结合，稳定其构象和功能，从而保护细胞完整性。这些发现首次将ScPV确认为一种新型抗冻蛋白，并阐明了其在提高酵母耐冻性方面的多重作用。

引言

冷冻面团技术在烘焙行业中显著提高了生产效率和物流分配。然而，在冷冻、储存和解冻过程中冰晶的形成和生长会导致严重的细胞脱水，从而产生机械应力，损害酵母细胞和面筋网络。这种损伤会降低面团质量，导致最终烘焙产品的品质下降（Camara & Sant'Ana, 2021; Cui, Wang, et al., 2023; Jia et al., 2012）。因此，抑制冰晶重结晶和提高酵母的耐冻性对于保持冷冻面团的质量至关重要。因此，应用抗冻剂已成为最有效和有前景的策略。

抗冻蛋白（AFPs）作为一种具有显著抗冻特性的天然大分子，通过热滞后效应和抑制冰晶重结晶来独特地控制冰晶生长（Chen et al., 2023）。鉴于其在营养和安全方面的优势（Yang et al., 2024），AFPs已成为冷冻面团的潜在抗冻剂。研究表明，来自植物、鱼类和昆虫等多种生物的AFPs可以通过与冰表面结合并改变冰晶形态来有效保护酵母免受冻害（Chen et al., 2023; Cui et al., 2021; Jia et al., 2012）。然而，天然AFPs通常较为稀缺，其工业化生产和纯化成本往往很高（Bang et al., 2013; Yang et al., 2024），这严重限制了它们在食品或微生物冷冻保存中的广泛应用。因此，开发成本低廉、易于生产的AFPs具有迫切需求。

小清蛋白（PV）是一种酸性、低分子量（约12 kDa）的可溶性蛋白质，对细胞内钙调节和肌肉松弛至关重要（Permyakov & Uversky, 2022; Schwaller et al., 2002）。PV在鱼类白肌中含量丰富，已分离并表征了三种银鱼PV异构体（Liu et al., 2010）。尽管PV的序列、分子结构及其在过敏反应或免疫反应中的作用已有详细记录（Chen et al., 2024; Zhao et al., 2017），但其生理功能和生物活性仍不完全清楚。先前的研究表明PV与南极鱼类的寒冷适应有关（Erickson et al., 2005; Permyakov & Uversky, 2022; Whittington & Moerland, 2012）。然而，关于其内在抗冻活性的直接证据及其作用机制仍有限。最近，我们的研究小组发现PV衍生的肽是银鱼肌肉水解物对酵母细胞具有优异抗冻效果的关键因素（Cui, Li, et al., 2023; Wang et al., 2021）。然而，完整的PV蛋白本身是否具有抗冻活性仍需通过实验验证。

银鱼的PV是一种在中国产量高但价值较低的淡水鱼（Wang et al., 2021），其特点是高水溶性和在广泛的温度和pH范围内具有稳定的性质（Liu et al., 2010），这使其可以从银鱼肌肉中轻松提取，或者在银鱼鱼糜制造过程中从冲洗废水中直接回收。通过简单的热处理还可以实现后续纯化并降低其致敏性（Li et al., 2024），且无需引入任何化学试剂。此外，通过糖基化等结构修饰可以有效地降低PV的抗原性（Wu, Lu, Huang, Lin, et al., 2022; Wu, Lu, Huang, Wang, et al., 2022; Zhao et al., 2017）。这些特性理论上使银鱼PV成为一种具有高技术经济可行性的抗冻蛋白，有望在大规模制备中克服应用障碍，但其抗冻效果和作用机制仍有待进一步阐明。因此，本研究旨在评估银鱼PV作为基于AFPs的抗冻剂在酵母中的潜力，并通过传统的实验、分子动力学模拟和转录组学分析来阐明其抗冻机制。

材料

新鲜银鱼（Hypophthalmichthys molitrix）鱼片，每块重500±50克，购自中国湖南省长沙的一个认证水产品批发市场。酵母来自湖北宜昌Angel Yeast有限公司提供的干酵母培养物。用于酵母培养和接种的麦芽提取物肉汤和马铃薯葡萄糖琼脂购自中国广州的广东华凯微生物科技有限公司。荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶

ScPV对酵母的抗冻效果

与Liu等人（2010）的研究结果一致，他们鉴定了三种ScPV异构体（PV-I、PV-II和PV-III），分子量分别约为12、11和14 kDa。我们的ScPV样品的SDS-PAGE分析（图S1a）显示在10至15 kDa之间有两个明显的蛋白质条带。这一观察结果与ScPV预期的分子量特征相符。此外，LC-MS/MS分析（图S1b）进一步确认样品中的主要成分是ScPV蛋白，且其他成分很少

结论

ScPV表现出典型的抗冻特性，包括可测量的热滞后活性和强大的冰晶重结晶抑制能力。将ScPV加入酵母后，显著提高了其耐冻性，表现为ΔΨm升高、存活率显著增加以及经过2次冻融循环后的存活率提高。我们认为ScPV通过三种互补机制在不同时间尺度上发挥作用，形成了一个协调的多层次防御系统，以抵抗冻融引起的损伤。

CRediT作者贡献声明

袁成志：撰写——初稿、验证、方法学、实验设计。唐彦峰：实验设计。何志刚：数据分析。李向红：资源协调、项目管理。黄一群：监督、数据分析。刘永乐：监督、数据分析、概念构思。王发祥：撰写——审稿与编辑、资金筹集、概念构思。

未引用参考文献

Luo et al., 2023

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（32372371, 32072251）和湖南省重点研发计划（2022NK2038）的支持。