李痘病毒（PPV）的高分辨率冷冻电镜结构解析揭示其衣壳蛋白的淀粉样特性及翻译后修饰调控机制

《Archives of Virology》：Structural characterization of plum pox virus by cryo-electron microscopy

本研究针对严重危害核果类作物的李痘病毒（PPV），利用冷冻电镜技术首次解析了其2.9 ?高分辨率结构，揭示了衣壳蛋白（CP）的螺旋组装模式及单链RNA（ssRNA）的封装机制。研究发现PPV衣壳蛋白核心结构高度保守，其N端无序区域存在丰富的磷酸化及O-GlcNAc修饰，并预测了淀粉样形成区域。该研究为理解马铃薯Y病毒科病毒的组装机制及开发抗病毒策略提供了重要结构基础。

　　

在核果类果树种植领域，李痘病毒（Plum pox virus, PPV）引发的鲨鱼痘病（sharka disease）堪称一场持续蔓延的"隐形风暴"。作为马铃薯Y病毒科（Potyviridae）中最具破坏性的成员之一，PPV通过蚜虫高效传播，感染桃、李、杏等蔷薇科作物，导致果实畸形、品质下降，甚至整株死亡。据统计，过去28年间该病毒造成的经济损失已超过24亿欧元，对全球果品产业构成持续威胁。尽管科学家早已认识到PPV的危害性，但其病毒颗粒的精细结构及其组装机制始终蒙着神秘面纱，这严重制约了高效防控策略的开发。

近日，研究团队在《Archives of Virology》发表突破性研究，通过冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）技术成功解析了PPV-M毒株的高分辨率结构，首次在近原子水平揭示了这一重要植物病毒的组装奥秘。该研究不仅描绘了病毒颗粒的精细三维结构，更发现了衣壳蛋白（coat protein, CP）中存在的淀粉样特性（amyloidogenic properties）及复杂的翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）调控网络，为理解病毒生命周期提供了全新视角。

研究团队采用多学科交叉技术路线：从感染PPV-M毒株的本氏烟（Nicotiana benthamiana）叶片中纯化病毒颗粒，通过蔗糖垫超速离心获得高纯度样品。利用Talos Arctica冷冻电镜采集2,508张显微图像，采用螺旋重构技术获得2.9 ?分辨率的三维结构。运用高分辨率质谱（nLC-HRMS）分析衣壳蛋白的翻译后修饰位点，结合AMYLPRED2和Espritz软件预测蛋白的淀粉样特性和无序区域，并通过AlphaFold2进行结构模拟验证。

结构分析揭示PPV病毒颗粒的螺旋组装特征

冷冻电镜重构显示PPV病毒颗粒呈典型的丝状结构，直径约130 ?，采用螺旋对称组装方式。研究人员通过手动选取4,069个病毒片段，利用冷冻电镜三维重构技术获得最终结构，其螺旋参数为轴向上升（ΔZ）4.08 ?，旋转角度（ΔΦ）-40.89°，每个螺旋层包含8.8个衣壳蛋白亚基。这一结构与同科的马铃薯Y病毒（PVY）高度相似，核心区域Cα原子的均方根偏差（RMSD）仅0.74 ?。

衣壳蛋白结构与RNA相互作用模式

结构分析表明，衣壳蛋白的核心结构域（Gln140-Asn290）形成中空圆柱体，而复杂的C末端区域延伸至管内，与相邻亚基形成广泛相互作用。特别值得注意的是，C末端的Asn223-Arg228残基呈现出淀粉样纤维样构象，其螺旋上升参数（3.75 ?）与典型淀粉样纤维极为接近。单链RNA位于衣壳蛋白核心与C末端区域形成的"腋窝"状沟槽中，每个不对称单元容纳5个核苷酸，其中4个朝向沟槽基部，1个反向取向。

衣壳蛋白的翻译后修饰景观

质谱分析鉴定出15个高置信度的磷酸化位点，主要分布在蛋白第71位残基之后的区域。其中一个磷酸化肽段（氨基酸71-93）还很可能含有HexNAc[S/T]类型的糖基化修饰。此外，N端区域检测到多个O-GlcNAc修饰，但由于该区域肽段较大且可能存在多种修饰共存，精确位点判定仍存挑战。这些修饰特别是N端区域的O-GlcNAc化，被认为通过调节蛋白稳定性在病毒感染过程中发挥精细调控作用。

无序区域与淀粉样特性预测

生物信息学分析显示，衣壳蛋白中有29.39%的残基处于无序状态，尤其N端前100个氨基酸中有77个（23.3%）为无序区域，这解释了为何冷冻电镜图中N端前140个氨基酸未能解析出清晰密度。AMYLPRED2软件预测出6个淀粉样形成区域，其中最长的包含14个氨基酸残基（171-184位）。这些区域在PPV与其他5种马铃薯Y病毒科病毒中具有保守性，提示其可能具有重要的生物学功能。

AlphaFold结构模拟验证

AlphaFold模拟生成的衣壳蛋白单体结构与冷冻电镜解析的结构高度一致，且八聚体模拟结果与病毒颗粒中观察到的8.8亚基/螺旋层的组装模式极为相似。数据库比对显示，PPV衣壳蛋白与番木瓜环斑病毒（papaya ringspot virus）衣壳蛋白结构同源性最高，而与一种含有RNA结合基序和"Poty_coat"结构域的RNA指导的RNA聚合酶C端结构域蛋白也显示出相似性。

该研究的讨论部分深入分析了PPV结构特征的功能意义。研究人员指出，衣壳蛋白N端区域的柔性对病毒功能实现至关重要：一方面，该区域包含与蚜虫传播相关的DAG基序（第11、12、13位氨基酸），可与辅助成分蛋白酶（HC-Pro）的PTK基序互作，形成传播复合体；另一方面，该区域的翻译后修饰（如O-GlcNAc化和磷酸化）可能通过调节蛋白稳定性，精确控制衣壳蛋白在病毒生命周期不同阶段的可用性。

特别值得关注的是，研究首次在PPV衣壳蛋白中发现了淀粉样特性，这为理解病毒组装机制开辟了新视角。病毒蛋白中的淀粉样区域可能作为"功能淀粉样物质"（functional amyloids），参与病毒颗粒的组装、稳定性维持或与宿主环境的相互作用，甚至可能成为抗病毒药物的新靶点。

磷酸化位点的结构定位分析揭示了其可能的功能分化：Ser137邻近相邻亚基的Lys236和Arg237，磷酸化可能增强亚基间静电相互作用，提高病毒颗粒稳定性；而Ser151靠近相邻亚基的酸性残基Glu205和Glu240，磷酸化可能引入静电排斥导致结构不稳定；内部埋藏的Thr254和Thr309等位点的磷酸化则可能需要病毒颗粒部分解聚才能发生，可能参与病毒解组装过程。

这项研究通过对PPV高分辨率结构的解析，不仅增进了对马铃薯Y病毒科病毒组装机制的理解，也为针对病毒衣壳蛋白开发新型抗病毒策略提供了结构基础。研究人员强调，衣壳蛋白中复杂的翻译后修饰网络、无序区域的动态特性以及新发现的淀粉样形成倾向，共同构成了病毒适应不同宿主环境和完成生命周期的分子基础。这些发现对未来设计干扰病毒组装或稳定性的新型防控手段具有重要指导意义。