质粒编码gadRCB操纵子增强植物乳杆菌ZR79酸耐受性的机制研究

《Applied Microbiology and Biotechnology》：A plasmid-borne gadRCB operon contributes to acid tolerance in Lactiplantibacillus plantarum ZR79

本研究针对植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)中γ-氨基丁酸(GABA)合成基因簇的遗传多样性和功能特性这一科学问题，通过比较基因组学和基因功能分析，首次发现质粒pZR79携带的gadRCB操纵子通过GAD系统催化L-谷氨酸转化为GABA，显著增强菌株的酸耐受性，为乳酸菌的代谢适应和益生特性研究提供了新视角。

　　

在发酵食品和肠道微生物组研究中，植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)作为重要的乳酸菌(LAB)备受关注。这类细菌在发酵过程中产生乳酸，既能抑制腐败菌生长，又能增强食品风味，但同时也面临自身产生的酸性环境挑战。酸性环境会破坏蛋白质和DNA等生物大分子，因此乳酸菌进化出了多种酸耐受机制，其中谷氨酸脱羧酶系统(GAD系统)尤为重要。然而，不同植物乳杆菌菌株中GAD系统的遗传组织和功能存在显著差异，这种菌株特异性变异的遗传基础尚不明确。

发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》的最新研究为解决这一问题提供了重要线索。研究人员从120株植物乳杆菌中成功筛选到一株高产γ-氨基丁酸(GABA)的菌株ZR79，该菌株在发酵48小时后不仅产生大量气体（CO₂），还将培养基pH值提升至4.52，而其他菌株的pH值普遍维持在4.0左右。这一现象引起了研究团队的浓厚兴趣，促使他们深入探索其背后的遗传机制。

研究人员采用PacBio Sequel和Illumina NovaSeq PE150平台对ZR79进行全基因组测序，结合比较基因组分析、基因敲除技术、实时定量PCR、RT-PCR和酸耐受性实验等关键技术方法，其中120株测试菌株来源于发酵食品和人类粪便样本。

GABA-producing L. plantarum ZR79

通过产气量和pH值变化双重指标筛选，发现仅有ZR79能推开培养管盖子并显著提高培养基pH，薄层色谱(TLC)进一步证实了其GABA合成能力。

Two glutamate decarboxylase genes were observed in L. plantarum ZR79

基因组分析揭示ZR79同时携带gadA和gadB两个谷氨酸脱羧酶基因，而20株非GABA产生菌仅含有gadA。gadB与质粒pLSW74_2中的同源基因相似度达99.86%，提示其可能通过水平基因转移获得。

The gadB gene was responsible for GABA biosynthesis

通过同源重组构建gadA和gadB插入失活突变体，TLC分析显示gadB突变体完全丧失GABA合成能力，证实gadB在GABA生物合成中的关键作用。

The specific gadRCB gene cluster was located on the plasmid pZR79

全基因组测序显示gadRCB操纵子位于50,173-bp的质粒pZR79上，该质粒GC含量仅39.6%，含有10个转座酶基因，复制起始区AT含量达74%，实时定量PCR显示其拷贝数约为每个细胞3个。

In silico analysis of the gadB gene and determination of the gadRCB operon

启动子预测发现gadR和gadC上游分别存在-61bp和-63bp的启动子序列，RT-PCR证实三者共转录为多顺反子操纵子，其下游存在典型的ρ非依赖性终止子结构。

Stable inheritance of plasmid pZR79 in L. plantarum ZR79

质粒稳定性实验表明，经过16天（约200代）连续传代，ZR79仍保持GABA合成能力，证明pZR79在宿主中稳定遗传。

The gadB contributes to acid tolerance in L. plantarum ZR79

酸耐受性实验显示，野生型ZR79在pH 3.0处理3小时后存活率达75.5%，gadA突变体为60.2%，而gadB突变体骤降至20.5%，证明gadB介导的GABA合成对酸耐受性至关重要。

研究结论表明，质粒pZR79携带的gadRCB操纵子通过水平基因转移获得，其编码的GAD系统不仅能高效合成GABA，还显著增强了植物乳杆菌的酸耐受性。这一发现首次揭示了质粒编码的gadRCB操纵子在植物乳杆菌中的存在和功能，为理解乳酸菌通过质粒介导的代谢适应机制提供了新视角，对开发高性能发酵剂和益生菌制剂具有重要应用价值。