靶向甲基化cg24067911通过BCL6-ATXN1-CDH1轴抑制结直肠癌转移的机制研究

《Oncogene》：Targeted methylation of cg24067911 suppresses colorectal cancer metastasis through BCL6-ATXN1-CDH1 axis

本研究针对结直肠癌(CRC)转移机制不明确的临床难题，利用CRISPR-dCas9-DNMT3a系统对潜在生物标志物cg24067911进行精准甲基化编辑。研究发现该位点位于ATXN1基因增强子区域，其低甲基化通过增强BCL6结合活性上调ATXN1表达，进而激活转录因子ATXN1对CDH2(N-cadherin)的调控，最终促进上皮间质转化(EMT)和肿瘤转移。该研究首次揭示cg24067911/ATXN1/CDH2轴在CRC转移中的表观遗传调控机制，为CRC预后预测和靶向治疗提供了新策略。

　　

在全球范围内，结直肠癌始终是威胁人类健康的重大疾病，其发病率和死亡率呈现持续上升趋势。更令人担忧的是，约20%的患者在初诊时已发生转移，即便接受根治性治疗的患者中仍有25%最终会出现转移。尽管科学家们对结直肠癌转移机制的研究已持续数十年，涉及遗传异常、转移起始细胞、上皮间质转化和肿瘤微环境等多个领域，但这些基础研究成果向临床实践的转化仍十分有限。转移性结直肠癌预后差、治疗选择有限，因此深入理解其转移机制对于开发有效治疗策略至关重要。

表观遗传修饰作为基因调控的主要媒介，在结直肠癌转移中扮演重要角色。DNA甲基化作为表观遗传调控的核心组成部分，已被证明是强有力的癌症诊断和预后标志物。研究表明，伴有转移和不伴转移的结直肠癌具有不同的DNA甲基化演化特征，且大多数DNA甲基化状态在转移发生前就已确立，提示DNA甲基化在结直肠癌转移中起推动作用。然而，以往研究多使用广谱甲基转移酶抑制剂（如地西他滨、阿扎胞苷等）来探索DNA甲基化功能，针对单个DNA甲基化位点在结直肠癌转移中作用的机制研究仍然缺乏。

CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)技术的出现为这一领域带来了革命性突破。通过将催化失活的Cas9(dCas9)与DNA甲基转移酶（如DNMT3A）融合，研究人员现在能够实现对特定基因组位点DNA甲基化模式的精准操控。这些创新工具使得探索DNA甲基化变化与癌症生物学表型之间的因果关系成为可能，并为开发靶向DNA甲基化的新型治疗策略铺平道路。

中山大学肿瘤防治中心团队前期基于801例结直肠癌患者和1021例对照的大规模队列，建立了具有高精度的循环游离DNA甲基化标志物预测诊断和预后模型。其中，cg24067911同时具有诊断价值和转移预测效应，提示其在结直肠癌转移中的潜在作用。值得注意的是，CpG位点cg24067911是一个尚未被研究报道的新型DNA甲基化位点，其宿主基因ATXN1是一个参与转录抑制的蛋白编码基因，也是Notch信号通路的组成部分。然而，大多数关于ATXN1的研究集中在神经学领域，其在癌症中的功能知之甚少。

发表在《Oncogene》的这项研究，利用CRISPR/dCas9-DNMT3a系统成功编辑了目标位点cg24067911的甲基化状态，并通过体内外实验证明了其在结直肠癌转移中的作用。研究人员进一步探索了下游关键基因ATXN1在结直肠癌中的功能，发现ATXN1可作为转录因子通过促进CDH2(N-钙黏蛋白)表达来诱导上皮间质转化(EMT)，从而促进结直肠癌转移。同时，研究也验证了cg24067911/ATXN1的临床意义。这些发现揭示了结直肠癌转移的新机制。

关键技术方法概述

研究团队采用CRISPR-dCas9-DNMT3a系统对cg24067911进行靶向甲基化编辑，通过高通量测序技术（ATAC-seq、RNA-seq）和染色质免疫沉淀(ChIP)分析表观遗传特征。利用体外迁移侵袭实验（Transwell、划痕愈合）和体内小鼠转移模型（脾脏注射、门静脉注射）验证功能表型。临床验证基于中山大学肿瘤防治中心的患者样本队列（40对组织用于dd-PCR，84对组织用于qRT-PCR，488对组织用于IHC），通过生物信息学分析（TCGA、Oncomine数据库）支持研究发现。

研究结果

cg24067911在结直肠癌转移中的作用鉴定

前期研究发现cg24067911低甲基化是结直肠癌的诊断和预后生物标志物

，结直肠癌组织中cg24067911甲基化水平显著低于正常组织。进一步研究显示，cg24067911低甲基化在结直肠癌进展过程中逐渐加剧，转移灶的甲基化水平显著低于匹配的原发肿瘤。此外，根治性切除后复发或转移的病例比非复发病例表现出更明显的低甲基化。这些数据共同强调了cg24067911低甲基化与疾病侵袭性相关。

为评估cg24067911低甲基化对结直肠癌进展的因果效应，研究人员采用CRISPR-dCas9-DNMT3a介导的DNA甲基化编辑系统上调目标CpG位点cg24067911的甲基化水平

P<0.05,P<0.01, and**P<0.001.'>

。研究发现，cg24067911位点特异性甲基化成功后，ATXN1 mRNA表达下调，且cg24067911位于ATXN1基因的增强子区域。染色质开放性测序(ATAC-seq)结果显示，dCas9-DNMT3a处理的DLD-1细胞系在cg24067911位点区域的染色质可及性降低。这些发现表明cg24067911甲基化可影响增强子功能。

cg24067911增强子的鉴定及其对ATXN1表达的调控影响

CpG位点cg24067911位于ATXN1的5'UTR区域，其甲基化有可能影响宿主基因的表达水平。RNA-seq结果显示，与对照组细胞相比，dCas9-DNMT3a细胞中ATXN1 mRNA表达下调。表观遗传特征分析发现，cg24067911区域富含H3K4me1和H3K27ac组蛋白修饰，表明cg24067911位于增强子区域，且结直肠癌细胞中H3K27ac的显著富集暗示该增强子在结直肠癌中被激活。

研究人员进一步探索了参与增强子功能过程的转录因子。通过JASPAR数据库和GeneHancer数据库预测可能结合cg24067911区域的转录因子，并基于TCGA结直肠癌队列的RNA-seq数据筛选出与ATXN1 mRNA水平显著相关的转录因子。研究发现，敲低BCL6表达可导致ATXN1 mRNA表达显著降低。染色质免疫沉淀(ChIP)实验证明BCL6能够结合cg24067911所在的增强子区域。

ATXN1促进结直肠癌转移

研究发现，下调ATXN1表达可显著降低结直肠癌细胞的迁移能力，而ATXN1过表达则促进结直肠癌转移。然而，ATXN1表达改变对细胞增殖能力没有显著影响。在DLD-1或HCT116 dCas9-sgRNA3细胞中过表达ATXN1后，细胞的迁移能力得到恢复。

体内实验进一步验证了ATXN1在结直肠癌中的功能，与阴性对照组相比，用shRNA-ATXN1处理的小鼠肝脏转移病灶显著减少。此外，利用dCas9-sgRNA3细胞构建肝转移模型，发现上调cg24067911甲基化水平显著减弱了结直肠癌的转移进程。这些结果与cg24067911甲基化/去甲基化的功能一致，提示cg24067911可能通过下游ATXN1影响结直肠癌转移。

ATXN1作为转录因子通过调控CDH2表达调节EMT

为探讨潜在机制，研究人员进行了GO/KEGG分析，发现cg24067911高甲基化和ATXN1低表达共同富集于细胞粘附相关通路。GSEA分析显示，上皮间质转化(EMT)通路在ATXN1功能中富集，这可能是cg24067911/ATXN1促进结直肠癌转移的基础。

Western blot和RT-qPCR证实，ATXN1可改变EMT标志物的表达，ATXN1敲低降低了CDH2(N-钙黏蛋白)表达，增加了CDH1(E-钙黏蛋白)表达。基于STRING数据库的蛋白质-蛋白质相互作用分析观察到ATXN1与CDH2之间存在直接关联，表明CDH2可能是cg24067911/ATXN1在结直肠癌转移中的关键效应因子。

ATXN1-ChIP实验证明ATXN1可结合CDH2启动子区(TSS-880~-597)。双荧光素酶报告基因表达检测发现，ATXN1与CDH2启动子结合可显著增加CDH2转录，且当结合位点突变时，这种效应减弱。这些发现阐明了潜在机制：cg24067911去甲基化增强ATXN1表达，ATXN1作为CDH2的转录因子增加N-钙黏蛋白表达，进而促进结直肠癌转移。

ATXN1在结直肠癌样本中的临床意义

通过RT-qPCR检测回顾性收集的结直肠癌样本和配对癌旁正常组织中的ATXN1表达，发现结直肠癌样本中ATXN1显著高于配对正常样本。基于结直肠癌患者的免疫组化染色结果，肿瘤组织中ATXN1表达高于正常组织。此外，高ATXN1表达在IV期患者、奥沙利铂耐药患者和复发疾病患者中更为突出。预后方面，ATXN1高表达患者的总生存期显著短于低表达患者，III期结直肠癌患者中无病生存期相对缩短。基于TCGA结直肠癌COAD队列的生存分析显示，ATXN1高表达与无病生存期降低相关。

P<0.05,P<0.01, and**P<0.001.'>

研究结论与讨论

本研究基于大规模临床人群筛查，通过体内外实验从机制上验证了cg24067911甲基化的作用。研究结果表明，结直肠癌中cg24067911低甲基化增强了与BCL6的结合，导致ATXN1上调并随后促进EMT。尽管靶向甲基化方法取得了良好的修饰效率，但这一观察结果与最近强调增强子区域位点特异性表观遗传编辑技术挑战的报告一致。不完全甲基化可能源于染色质可及性障碍，因为BCL6结合的增强子的天然开放构型可能抵抗DNMT3A介导的甲基化，加上组蛋白修饰串扰的潜在影响。

尽管ATXN1之前被报道能够以Notch依赖性方式调节EMT，但N-钙黏蛋白调控的表观遗传机制尚未完全阐明。本研究首次揭示cg24067911甲基化下调ATXN1表达，而ATXN1是CDH2的转录因子，从而导致N-钙黏蛋白上调，促进结直肠癌细胞EMT并削弱细胞间粘附，促进结直肠癌转移。

结直肠癌发病机制中cg24067911的反复低甲基化可能源于多方面的机制，其中区域癌化可能在癌前上皮中启动早期去甲基化，为后续致癌突变创造许可染色质，而同时发生的BCL6-ATXN1轴失调可能通过甲基化缺失稳定BCL6结合，形成促进ATXN1抑制的正反馈循环。临床上，这些甲基化动力学具有双重前景：通过纵向监测作为液体活检早期检测生物标志物，以及作为治疗脆弱性，其中EZH2抑制剂可能潜在地破坏BCL6依赖性。

该研究源自大规模队列分析，并通过体内外实验从机制上验证了cg24067911甲基化的作用。研究发现结直肠癌中cg24067911低甲基化增强了与BCL6的结合，导致ATXN1上调并随后促进EMT。需要进一步研究来评估CRISPR/dCas9-DNMT3a在cg24067911上对结直肠癌的临床应用潜力。