基于牛尿馏分的铜纳米颗粒绿色合成、工艺优化及其抗菌、抗氧化和抗糖尿病活性评估

《Scientific Reports》：Eco-synthesis, process optimisation, and therapeutic assessment of cow urine distillate derived copper nanoparticles

本研究针对传统纳米材料合成方法存在毒性大、成本高、环境风险高等问题，开发了一种利用牛尿馏分(CUD)绿色合成铜纳米颗粒(CUD-CuNPs)的新方法。研究人员采用Box-Behnken设计优化合成工艺，系统表征了纳米颗粒的理化性质，并评估了其抗菌、抗氧化及抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性。结果表明，CUD-CuNPs对多种病原菌具有显著抑制作用，并展现出优异的自由基清除能力和抗糖尿病潜力，为开发可持续的纳米药物提供了新策略。

　　

在纳米技术蓬勃发展的今天，金属纳米颗粒因其独特的物理化学性质在生物医学领域展现出巨大应用潜力。其中，铜纳米颗粒(CuNPs)相比金银等贵金属具有资源丰富、成本低廉、环境友好等优势，在抗菌、抗氧化和催化等方面表现出优异性能。然而，传统的化学还原法、物理气相沉积法等合成方法往往需要使用有毒溶剂、能耗高且存在环境风险，这严重限制了CuNPs的临床应用前景。

正是在这样的背景下，绿色合成策略应运而生——利用植物、微生物或动物来源的天然还原剂和稳定剂来制备纳米材料。值得注意的是，在古老的阿育吠陀传统医学中，牛源性产品早已被认识到具有治疗潜力。牛尿馏分(CUD)作为一种纯化的生物流体，含有丰富的有机酸、含氮化合物、维生素、尿素、肌酐等多种生物活性分子，具有较强的还原、抗氧化、抗菌和免疫调节特性，使其成为绿色合成的理想候选材料。然而，此前尚未有研究系统探讨利用CUD在受控和优化环境中绿色合成CuNPs的可行性，以及CUD介导的CuNPs(CUD-CuNPs)在治疗微生物感染、氧化应激和代谢紊乱等方面的潜力。

为了解决这一知识空白，发表在《Scientific Reports》上的这项研究开创性地将传统知识与现代纳米技术相结合，开发了一种可持续、简单、经济且无毒的CUD-CuNPs生物合成方法。研究团队采用质量源于设计(QbD)策略，通过Box-Behnken实验设计系统优化了还原剂浓度、pH、反应温度和反应时间等关键工艺参数，成功制备出了具有理想特性的纳米颗粒。

研究人员通过多种表征技术确认了CUD-CuNPs的成功合成。紫外-可见光谱在269-275纳米处显示出特征表面等离子体共振(SPR)吸收峰，证实了纳米颗粒的形成。傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析揭示了CUD中的生物分子在还原和稳定铜离子中的关键作用。透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)显示纳米颗粒呈球形，粒径在20-40纳米之间。X射线衍射(XRD)分析证实了纳米颗粒的晶体结构，在43.4°、50.5°和74.2°处有明显的衍射峰。动态光散射(DLS)测得的平均流体动力学粒径为232.76纳米，多分散指数(PDI)为0.421，zeta电位为-16.45毫伏，表明纳米颗粒具有适中的稳定性。

关键技术方法方面，研究首先从印度牛(Bos indicus)中无菌采集尿液，通过玻璃蒸馏装置在40-50°C下蒸馏获得CUD。随后采用生物还原法，在优化条件下(1%还原剂浓度、pH 5.23、44.71°C、4小时)合成CUD-CuNPs。利用Box-Behnken设计优化工艺参数，并通过紫外-可见光谱、FTIR、SEM-能量色散X射线光谱(EDAX)、TEM、XRD和动态光散射等技术系统表征纳米颗粒。生物学评价包括针对四种病原菌的琼脂扩散法抗菌实验、DPPH/一氧化氮/过氧化氢自由基清除抗氧化实验，以及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制抗糖尿病实验。

优化CUD-CuNPs

通过Box-Behnken设计(BBD)对合成工艺进行优化，建立了还原剂浓度(X₁)、pH(X₂)、温度(X₃)和反应时间(X₄)与粒径(Y₁)、zeta电位(Y₂)、PDI(Y₃)和SPR峰值波长(Y₄)之间的数学模型。方差分析(ANOVA)显示所有二次模型均具有高度显著性(p < 0.0001)，调整R2值接近1，表明模型拟合良好。数值优化得出最佳合成条件为：还原剂浓度1%、pH 5.23、温度44.71°C、反应时间4小时。验证实验结果显示预测值与实验值高度吻合，证实了模型的准确性和可靠性。

CUD-CuNPs合成的 proposed mechanism

研究提出了CUD介导的CuNPs合成机制：CUD中的多种生物还原分子(如酚类、尿囊素、尿酸等)将铜离子(Cu²⁺)还原为铜原子(Cu⁰)，这些原子聚集形成稳定的核，随后通过吸引更多还原铜或与其他新生颗粒合并而生长成纳米颗粒。同时，CUD中的生物分子还作为有效的稳定剂和封端剂，通过吸附在纳米颗粒表面防止聚集，并调控最终颗粒的尺寸和形状。

光学分析 using UV-Vis absorbance spectroscopy

UV-Vis光谱分析显示，CUD-CuNPs在269-275纳米处有明显的SPR吸收带，溶液颜色变为绿色，直观证实了纳米颗粒的形成。反应在3分钟内完成，pH 5.23被证明是Cu²⁺离子转化为CuNPs的最有效条件。

Functional group analysis by FT-IR

FT-IR分析揭示了CUD和CUD-CuNPs的功能基团特征。CUD在3332.99厘米^-1处的宽吸收带归因于O-H伸缩振动，1597.06厘米^-1和1550.77厘米^-1处的峰分别对应芳香族C=C弯曲和C-C伸缩振动。CUD-CuNPs在3572.17厘米^-1处显示O-H伸缩振动，609.51厘米^-1和678.94厘米^-1处的峰对应Cu-O振动，证实了CuNPs的形成。与CUD谱图相比，CUD-CuNPs谱图中特征峰的位移和强度变化表明CUD中的有机成分不仅作为反应介质，还在铜离子的生物还原和所得CuNPs的稳定中发挥关键作用。

Microstructural and elemental analysis using SEM-EDAX and TEM techniques

SEM和TEM分析显示CUD-CuNPs呈球形形态，TEM测得的粒径为20-40纳米。EDAX分析证实了铜元素的存在，并检测到碳、氧、镁、硅、硫、钾和氯等元素，其中碳和氧来源于CUD中有机生物分子形成的封端层，其余元素为CUD中天然存在的矿物质和电解质。选区电子衍射(SAED)进一步证实了纳米颗粒的晶体结构。

XRD analysis

XRD分析在2θ为29.32°、43.4°、47.48°、50.5°和74.2°处观察到衍射峰，表明CUD-CuNPs具有晶体结构。根据Scherrer方程计算得出的晶粒尺寸为29.98纳米，与纳米尺度相符。峰的锐度和清晰分辨率表明纳米颗粒具有良好有序的原子结构。

Particle size analysis

动态光散射分析显示CUD-CuNPs的平均流体动力学粒径为232.76±15.25纳米，PDI为0.421±0.05，zeta电位为-16.45±0.23毫伏。DLS测得的粒径远大于XRD计算的晶粒尺寸，表明纳米颗粒在溶液中形成了聚集体。zeta电位的负值表明CUD中的阴离子生物分子吸附在纳米颗粒表面，提供静电排斥作用，有助于防止聚集。

In-vitro antibacterial activity

抗菌实验显示CUD-CuNPs对革兰阳性菌(表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)和革兰阴性菌(大肠杆菌和铜绿假单胞菌)均具有显著抑制作用。CUD-CuNPs对表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制圈直径均为25.66±0.57毫米，对铜绿假单胞菌和大肠杆菌的抑制圈直径分别为24.00±1.00毫米和22.66±0.57毫米，效果与标准抗生素相当。CuNPs的抗菌机制涉及破坏细菌细胞壁和膜、产生活性氧以及干扰必需蛋白质和DNA。

In-vitro antidiabetic activity

抗糖尿病活性评估显示，CUD-CuNPs对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为30.88±1.07微克/毫升和24.94±1.02微克/毫升，显著优于CUD(IC₅₀值分别为33.77±0.00和27.43±0.03微克/毫升)和标准药物阿卡波糖(IC₅₀值分别为41.05±0.98和37.39±0.96微克/毫升)。这表明CUD-CuNPs具有更强的酶抑制活性，能有效延缓碳水化合物分解和葡萄糖进入血液的速度。

In-vitro antioxidant activity

抗氧化实验表明，CUD-CuNPs在DPPH、一氧化氮和过氧化氢自由基清除实验中均表现出显著活性，IC₅₀值分别为28.27±1.02、19.21±1.31和34.04±1.04微克/毫升，优于CUD。虽然不及抗坏血酸标准品(IC₅₀值分别为13.12±0.85、18.75±1.25和20.41±1.05微克/毫升)，但CUD-CuNPs展现出的自由基清除能力表明其在缓解氧化应激相关疾病方面具有潜力。

本研究成功建立了一种可持续、经济、无毒的CUD-CuNPs绿色合成方法，并通过系统的工艺优化和全面的性能表征，证实了其在抗菌、抗糖尿病和抗氧化方面的显著活性。CUD-CuNPs对多种病原菌的抑制效果与标准抗生素相当，对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性优于传统抗糖尿病药物，同时展现出强大的自由基清除能力。这些发现不仅为纳米材料的绿色合成提供了新策略，也为开发基于传统知识的创新纳米药物奠定了坚实基础。尽管研究目前仅限于体外实验，缺乏体内数据和特异性毒性研究，但它为后续更复杂的体内功效、毒理学和药代动力学研究提供了重要框架。该研究符合联合国可持续发展目标，特别是在良好健康与福祉、负责任消费和生产以及陆地生命方面做出了积极贡献，为资源有限地区开发可扩展、经济高效的纳米药物提供了新思路。