铜绿假单胞菌感染中T3SS效应蛋白ExoY通过cGMP信号通路调控ExoT细胞毒性的新机制

《Nature Communications》：Interplay between T3SS effectors, ExoY activation, and cGMP signaling in Pseudomonas aeruginosa infection

本研究揭示了铜绿假单胞菌III型分泌系统效应蛋白ExoY通过合成cGMP调控共注射效应蛋白ExoT细胞毒性的新机制。研究人员通过构建ExoY底物特异性变体菌株，发现ExoY产生的cGMP可减缓ExoT介导的宿主衔接蛋白CrkII去磷酸化，从而抑制细胞收缩。该研究阐明了T3SS效应蛋白间的复杂互作网络，为理解细菌致病机制提供了新视角。

　　

铜绿假单胞菌是一种广泛存在的机会性病原体，尤其在医院获得性感染中扮演着重要角色。这种细菌的致病性很大程度上依赖于其III型分泌系统（Type III Secretion System, T3SS），该系统能够将效应蛋白直接注入宿主细胞，扰乱细胞正常功能。在铜绿假单胞菌的T3SS效应蛋白中，ExoS、ExoT和ExoU因其直接导致细胞死亡的能力而被广泛研究，而ExoY的功能却一直存在争议。ExoY是一种核苷酸环化酶（nucleotidyl cyclase, NC），能够在宿主细胞内合成多种环核苷酸单磷酸（cyclic nucleotide monophosphates, cNMPs），尤其偏爱产生cGMP。尽管超过80%的铜绿假单胞菌菌株携带exoY基因，但其在感染过程中的具体作用机制尚不明确，不同研究之间的结果也存在矛盾。

为了阐明ExoY在感染过程中的功能，特别是其产生的cGMP的作用，来自法国巴斯德研究所等机构的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们通过巧妙的蛋白质工程手段，构建了一系列ExoY变体，这些变体具有不同的底物特异性，从而能够特异性地研究不同cNMPs的生理功能。

研究人员主要运用了蛋白质工程与定点突变、酶动力学分析、细胞感染模型与实时成像、cNMP报告系统与ELISA检测、Western blot蛋白质分析以及CRISPR-Cas9基因编辑等技术方法。他们利用临床相关的铜绿假单胞菌PAO1菌株背景，通过等位基因交换技术将不同的exoY变体引入细菌基因组，确保效应蛋白以天然水平表达和分泌，避免了以往研究中因质粒过表达可能造成的偏差。

修饰ExoY核苷酸结合口袋以改变底物特异性

研究团队首先基于ExoY的晶体结构，对其核苷酸结合口袋中的关键氨基酸进行替换，成功构建了三种ExoY变体：ExoYmut1、ExoYmut2和ExoYmut3。体外酶活实验表明，这些变体的底物偏好性发生了显著改变。例如，ExoYmut1几乎丧失了合成cGMP的能力，但保留了合成cAMP的活性；而ExoYmut2和ExoYmut3则表现出显著增强的腺苷酸环化酶（AC）活性。随后，他们在人支气管上皮细胞系NCI-H292中验证了这些变体的功能，通过GloSensor报告系统和小分子ELISA检测，确认了这些ExoY变体在细胞内能够产生预期的cNMPs模式，从而为后续功能研究奠定了基础。

在NCI-H292细胞中，ExoY衍生的cGMP减弱了ExoT的细胞毒性，而非ExoS的细胞毒性

通过感染表达不同ExoY变体的铜绿假单胞菌菌株，并利用实时活细胞成像技术定量分析细胞形态变化，研究人员发现，当ExoT与能够产生cGMP的野生型ExoY或ExoYmut2共注射时，ExoT诱导的细胞收缩（细胞变圆）速度显著慢于与不能产生cGMP的ExoY变体（如ExoYmut0、ExoYmut1或ExoYmut3）共注射的情况。这表明ExoY产生的cGMP能够特异性抑制ExoT的细胞毒性。有趣的是，ExoY对另一种效应蛋白ExoS的细胞毒性则没有明显的抑制作用。进一步分析发现，当ExoS与ExoY共注射时，细胞内cGMP的水平远低于ExoT与ExoY共注射时，提示ExoS可能通过其ADP-核糖基转移酶（ADPRT）活性干扰了ExoY的激活。

ExoY合成的cGMP特异性改变ExoT ADPRT活性的下游效应

ExoT和ExoS都是双功能毒素，包含一个N端的GTP酶激活蛋白（GAP）结构域和一个C端的ADP-核糖基转移酶（ADPRT）结构域。为了确定ExoY cGMP调控的是ExoT的哪个功能域，研究人员构建了ExoT和ExoS的GAP和ADPRT活性失活突变体。感染实验表明，在NCI-H292细胞中，ExoT诱导的细胞收缩主要由其ADPRT活性驱动。随后，他们构建了一个嵌合毒素，将ExoT的ADPRT结构域替换为ExoS的ADPRT结构域。当这个嵌合毒素与不能产生cGMP的ExoY变体共注射时，其细胞毒性未被抑制，而与野生型ExoY共注射时，细胞毒性则被抑制。这证实了ExoY cGMP的调控作用特异性地针对ExoT的ADPRT结构域，而非其GAP结构域，并且ExoS的ADPRT结构域对cGMP的调控不敏感。

CrkII是ExoT ADPRT活性被ExoY诱导的cGMP调控的下游靶点

已知ExoT的ADPRT域主要靶向Crk家族蛋白。研究人员利用CRISPR-Cas9技术敲除了NCI-H292细胞中的crk基因，发现Crk缺陷细胞对ExoT诱导的细胞收缩不敏感，并且不同ExoY变体菌株感染后的细胞收缩曲线没有显著差异。通过回补实验，他们进一步确定CrkII是ExoY cGMP调控ExoT细胞毒性的关键分子。Western blot分析显示，ExoT的ADPRT活性会导致CrkII在Y221位点的去磷酸化，而ExoY产生的cGMP能够减缓这一去磷酸化过程。当在感染培养基中加入能够提高细胞内cGMP水平的化合物（如Spermine NONOate或8-Br-cGMP）时，即使感染不能产生cGMP的ExoYmut0菌株，ExoT诱导的CrkII去磷酸化也被延缓。这直接证明了cGMP在调控CrkII磷酸化状态中的核心作用。

ExoT细胞毒性的ExoY抑制取决于细胞模型

为了验证上述发现的普适性，研究团队在HeLa细胞和A549肺泡上皮细胞中重复了感染实验。结果表明，ExoY对ExoT细胞毒性的调控作用具有细胞类型依赖性。在HeLa细胞中，ExoT的细胞毒性同时依赖于其GAP和ADPRT活性，因此ExoY cGMP的抑制作用较弱。而在A549细胞中，ExoT的细胞毒性几乎完全由其GAP活性驱动，并且A549细胞中CrkII的表达水平极低，这解释了为什么ExoY cGMP在此细胞模型中无法抑制ExoT的细胞毒性。此外，研究还发现，表达高AC活性ExoY变体（ExoYmut2和ExoYmut3）的菌株在HeLa和A549细胞中会注入更多的ExoT蛋白，导致更强的细胞毒性，其具体机制尚待阐明。

本研究揭示了铜绿假单胞菌T3SS效应蛋白之间存在一种精细而复杂的调控网络。ExoY通过合成cGMP，能够特异性拮抗ExoT ADPRT活性介导的细胞毒性，从而可能帮助细菌精细调控其毒力，以适应不同的宿主环境，或许有利于建立或维持慢性感染。同时，其他效应蛋白（如ExoS）或ExoT的GAP活性又可能通过干扰ExoY的激活（可能通过破坏其激活剂F-肌动蛋白）来限制其功能。这种上下文依赖的活性可能是导致以往关于ExoY功能研究结果不一致的原因之一。该研究不仅阐明了ExoY在铜绿假单胞菌致病机制中的新功能，也强调了在天然表达水平和特定细胞背景下研究细菌毒力因子的重要性，为未来开发针对细菌感染的新型治疗策略提供了新的思路和靶点。