综述：植物精确DNA插入技术的演进格局

《Nature Communications》：The evolving landscape of precise DNA insertion in plants

本综述系统梳理了植物精确DNA插入技术从随机整合到CRISPR-Cas时代的演进历程，重点分析了基因打靶(GT)、引导编辑(PE)、重组酶/转座酶系统等工具在作物改良中的应用潜力，并探讨了当前大片段插入效率、递送屏障等关键挑战的解决方案，为植物合成生物学发展提供了重要技术路线图。

　　

植物精确DNA插入技术的演进历程

精准将外源DNA插入植物基因组特定位置是作物生物技术的核心目标。自1980年代以来，遗传工程技术通过整合遗传物质实现了传统育种难以获得的新性状。然而，随机插入方法存在多位点整合、转基因沉默等局限性，促使科学家开发更精确的DNA整合策略。

随机DNA插入技术

转基因技术通过农杆菌介导转化、基因枪法等将外源基因随机整合到植物基因组。虽然这些方法在功能基因组学研究、分子农业等领域取得重要进展，但随机整合导致的位置效应和表达不稳定性限制了其应用。为应对这一挑战，科学家开发了顺式基因和内基因技术，仅使用有性兼容物种的遗传材料，但依然无法解决随机整合的根本问题。

前CRISPR-Cas时代的精确DNA插入

位点特异性重组(SSR)系统利用Cre-lox、FLP-FRT等重组酶在预设"着陆位点"进行DNA交换，但需要预先在基因组中引入重组位点。与此同时，基因打靶(GT)技术利用同源重组(HR)机制实现等位基因替换，但植物体细胞中HR效率极低(约10^-4)，限制了其广泛应用。关键突破发现，在重组位点引入特异性双链断裂(DSB)可将GT效率提高数个数量级，这为 programmable nucleases的应用奠定了基础。

CRISPR-Cas系统引领的技术革命

CRISPR-Cas系统的出现彻底改变了植物基因组编辑领域。这一原核生物适应性免疫系统通过向导RNA(gRNA)介导Cas蛋白在特定位点产生DSB，为精确DNA插入提供了全新工具。

基于CRISPR-Cas的DNA插入策略

NHEJ介导的精确序列插入通过利用细胞主要的DSB修复通路，将化学修饰的双链寡核苷酸(dsODN)直接插入CRISPR-Cas诱导的断裂位点。定向双链寡核苷酸靶向插入(DOTI)技术可实现高达71.75%的插入效率，特别适用于短片段插入。

同源重组介导的基因打靶作为金标准方法，可实现无缝、高保真的DNA插入。通过粒子轰击或农杆菌递送同源供体模板，GT可实现长达11.1kb的大片段插入。近年来，通过将供体DNA与CRISPR-Cas复合物拴系，或使用geminiviral replicon系统扩增供体浓度，GT效率得到显著提升。

引导编辑技术的突破性进展

PE系统通过nCas9在靶位点产生单链断裂，利用pegRNA携带的逆转录模板直接"书写"新遗传信息，避免了DSB的产生。PE最适合短至中等长度(<500bp)的插入，当与重组酶结合时，PrimeRoot平台可实现长达18.8kb的大片段插入。

转座酶辅助的靶位点整合(TATSI)系统将CRISPR-Cas与Pong转座酶融合，实现"剪切-粘贴"式DNA插入，可携带长达8.994kb的基因表达框，在拟南芥和大豆中实现6%-36%的插入效率。

技术应用与瓶颈突破

位点特异性蛋白标记通过HiBiT发光肽标签或荧光蛋白标记，实现了内源蛋白的实时追踪和功能分析。顺式调控元件工程通过精确插入增强子等调控序列，实现了基因表达的精细调控，为作物性状改良提供了新策略。

技术挑战与未来展望

当前精确DNA插入技术仍面临插入效率与负载大小的平衡、组织培养依赖性、递送瓶颈等挑战。未来发展方向包括开发新一代PE系统、利用AI优化编辑元件、创新递送策略等。随着这些技术的成熟及其与生物安全标准的统一，CRISPR-Cas介导的精确DNA插入技术将为下一代作物改良提供核心支撑。