植物线粒体核糖体翻译状态与组装机制的结构解析揭示其独特进化路径

《Nature Communications》：Structural insights into cauliflower mitoribosome in translation state and in association with a late assembly factor

本研究通过冷冻电镜技术首次解析了花椰菜线粒体核糖体在翻译状态及与晚期组装因子RsgA结合的高分辨率结构，揭示了其含有P位点tRNA、mRNA片段及新生肽链的复合物构象。研究人员鉴定了19种rRNA修饰，并发现植物特有的RsgA C端延伸通过阻塞mRNA通道防止小亚基成熟前mRNA结合。该研究阐明了开花植物线粒体翻译的独特机制，为理解真核生物mitoribosome的多样性进化提供了重要见解。

　　

在真核生物的能量工厂——线粒体中，存在着一类特殊的蛋白质合成机器——线粒体核糖体（mitoribosome）。与细菌核糖体相比，这些细胞器内的核糖体在进化过程中展现出了惊人的多样性，特别是在植物中，它们演化出了独特的结构特征，包括由植物特异性蛋白质稳定的额外rRNA结构域。然而，植物mitoribosome在翻译状态下的结构特异性长期以来仍是未解之谜。

近期发表在《Nature Communications》的一项研究突破了这一瓶颈。由Vasileios Skaltsogiannis、Philippe Giegé和Florent Waltz领导的研究团队利用冷冻电镜（cryo-EM）技术，成功解析了花椰菜（cauliflower）mitoribosome的高分辨率结构，包括其翻译状态和成熟状态。这项研究不仅揭示了mitoribosome与肽酰位点（P-site）tRNA、mRNA片段及新生肽链结合的精细结构，还首次系统鉴定了植物mitoribosome中的rRNA修饰谱，并发现了一个与小亚基（SSU）晚期组装中间体相关的关键组装因子RsgA的作用机制。

关键技术方法

研究团队从花椰菜中纯化线粒体和mitoribosome，分别使用氯霉素（chloramphenicol）或非水解GTP类似物（GTPγS）处理以捕获翻译停滞或组装中间状态。通过单颗粒冷冻电镜技术解析了三个主要结构：分辨率达2.1?的完整核糖体、3.0?的带有P位点tRNA的停滞核糖体，以及2.2?的与RsgA结合的小亚基组装中间体。结合纳米孔直接RNA测序（nanopore direct RNA sequencing）和质谱分析（mass spectrometry）系统鉴定rRNA修饰。利用ModelAngelo软件进行无偏见的蛋白质鉴定和模型构建。

植物特异性核糖体蛋白的结构特征

研究揭示了植物mitoribosome由85个核糖体蛋白组成（47个在大亚基LSU，38个在小亚基SSU），其中10个为植物特异性蛋白，包括8个PPR（pentatricopeptide repeat）蛋白。高分辨率结构首次清晰解析了之前未能明确识别的4个PPR蛋白的空间定位。

在大亚基中，重塑的26S rRNA结构域III由mL104（rPPR9）和mL101（rPPR4）主导稳定，并发现了一个新的核糖体蛋白bL25-2m。小亚基最具特色的是其头部延伸结构，该研究将分辨率提升至约4?，明确了mS80（rPPR6）和mS81（rPPR8）在此区域的精确定位——mS81通过两个PPR模块包裹并形成头部延伸的尖端。此外，研究还发现mS77（另一个PPR蛋白）位于mRNA通道出口，可能作为招募mRNA或翻译因子的平台。

花椰菜mitoribosome含有19种rRNA修饰

通过冷冻电镜、纳米孔测序和质谱三种技术，研究共鉴定出39个潜在的rRNA修饰位点，其中19个得到至少两种方法的支持而被确认为共识修饰。这些修饰包括8个假尿苷（pseudouridine, Ψ）和3种2'-O核糖甲基化（Nm），形成了围绕解码中心和肽基转移酶中心（PTC）的功能簇。

在解码中心附近，发现了保守的甲基化残基m⁶₂A1827和m⁶₂A1828，以及m⁴Cm1664（与mRNA直接相互作用）等修饰。在PTC区域，鉴定出了高度保守的Gm2560和Um2857。与仅保留少量修饰的哺乳动物和酵母mitoribosome相比，植物mitoribosome保留了更多其细菌祖先的修饰特征，表明其遵循了不同的进化路线。

翻译状态mitoribosome的植物特异性特征

通过氯霉素处理捕获的翻译停滞状态结构显示，氯霉素在PTC的结合模式与细菌核糖体几乎相同，证实了其抑制机制的保守性。研究解析了mRNA通道内六个核苷酸与P位点tRNA反密码环的相互作用，并揭示了mRNA通道入口和出口的植物特异性特征。

特别值得注意的是，在mRNA出口通道处，植物特异性蛋白mS77和mS86可能通过稳定mRNA相互作用，在植物特异性翻译起始过程中发挥重要作用。这些特征表明植物mitoribosome在mRNA招募机制上已发生显著重塑。

RsgA通过植物特异性延伸阻止mRNA提前结合

研究成功捕获了一个与小亚基组装因子RsgA结合的晚期组装中间体。结果显示，植物RsgA具有一个66个氨基酸的C端延伸，该延伸折叠成一个α螺旋，插入mRNA通道入口处的uS3m、uS5m和uS4m蛋白之间，物理阻断mRNA通道，从而防止在不完全成熟的小亚基上发生mRNA的提前结合。

系统发育分析表明，RsgA的C端延伸在陆地植物中广泛保守。有趣的是，在人类mitoribosome小亚基生物发生过程中，这一功能由组装因子RBFA通过其线粒体特异性C端延伸实现。这表明尽管RsgA和RBFA进化上不相关，但它们在植物和人类线粒体中独立进化出了通过阻塞mRNA通道来控制组装过程的类似机制，是趋同进化的典型例证。

研究结论与意义

这项研究通过高分辨率结构生物学技术，深入揭示了植物线粒体翻译装置的结构和功能特性。研究发现植物mitoribosome在进化上既不同于细菌核糖体，也不同于其他真核生物的mitoribosome。其PTC区域保持了细菌特征的保守性，而mRNA通道则通过植物特异性蛋白（如mS77）发生了重塑。rRNA的扩张段和PPR蛋白的招募共同形成了独特的植物特异性结构域。

研究还发现植物mitoribosome保留了较多细菌型rRNA修饰，与修饰极少的哺乳动物和酵母mitoribosome形成鲜明对比。对RsgA组装中间体的结构解析揭示了一种植物特异性机制，通过该机制确保小亚基在完全成熟前不会不适当地结合mRNA。

这些发现不仅增进了对植物线粒体翻译机制的理解，也揭示了mitoribosome在不同真核生物谱系中的多样化进化路径。植物mitoribosome的独特特征可能是其适应植物特异性功能所需，如解码比其它真核生物更复杂多样的mRNA集合。该研究为理解细胞器基因表达的进化提供了重要见解，并对未来研究植物线粒体功能及相关疾病具有重要指导意义。