超嗜热古菌Sulfolobus islandicus中染色体整合位点的发现、特征分析及其应用

《TRENDS IN Biotechnology》：Discovery, characterization, and application of chromosomal integration sites in the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus islandicus

利用CRISPR-COPIES技术系统鉴定并验证了13个crRNA靶向的8个染色体整合位点，通过β-半乳糖苷酶检测证实其异源基因表达功能，并基于此成功过表达GrsB酶调控脂质醚成分，为解偶联菌合成生物学研究提供了新型遗传工具。

　　

技术准备情况

热原体门（Thermoproteota，以前称为Crenarchaeota）的成员是研究进化历史和开发生物技术应用的关键模型。它们具有易于遗传操作的特性、对高温和酸性的耐受性，以及独特的生理和代谢特征，使其成为基础研究和应用研究的理想系统。为了利用这些特性，我们在Sulfolobus islandicus中发现了染色体整合位点，并对其进行了表征，从而建立了一个可靠的无需标记的菌株构建框架。这一策略补充了现有的基于质粒的同源基因表达方法，同时避免了与质粒维护相关的变异性、不稳定性和适应性成本。我们通过表达一个异源报告基因（lacS）验证了这些整合位点，并通过过表达GrsB酶展示了其在代谢工程中的实用性，成功调节了脂质醚的组成。由于这些染色体位点在多个Sulfolobus菌株中都是保守的，因此这项技术很可能可以转移到相关物种中。这些经过充分表征的位点为超嗜热古菌的多基因组工程和合成生物学奠定了基础，可直接应用于蛋白质表达和代谢途径设计。

亮点

我们使用针对Sulfolobus islandicus M.16.4及其内源性I-A型CRISPR-Cas系统的更新版CRISPR-COPIES流程，鉴定出了66个靶向21个基因间区域的crRNA。

我们将基因组学和表观基因组学数据整合起来，以确定优先进行实验表征的位点。

使用β-半乳糖苷酶检测方法，验证了13个crRNA对8个整合位点的功能。

通过使用已鉴定的位点过表达GrsB酶，调节了脂质醚的组成，增加了脂质醚中的环戊烷基团数量。

这项工作扩展了Sulfolobus的遗传工具箱，为工业生物技术和药物递送应用开辟了新的途径。

摘要

Sulfolobus islandicus作为一种新兴的古菌模式生物，由于其能够在极端环境中生存，因此在代谢工程和合成生物学应用中具有独特的优势。尽管已经为这种生物建立了多种遗传工具，但由于缺乏经过充分表征的染色体整合位点，其作为细胞工厂的潜力受到了限制。在这里，我们利用CRISPR-COPIES流程和多组学信息计算工作流程，系统地鉴定并表征了13个靶向S. islandicus中8个整合位点的人工CRISPR RNA。我们利用内源性的CRISPR-Cas系统整合了报告基因lacS，并通过β-半乳糖苷酶检测验证了异源基因的表达，发现了显著的位置效应。作为概念验证，我们利用这些位点通过过表达甘油二植烷基甘油四醚（GDGT）环合成酶B（GrsB）来操纵脂质醚的组成。这项研究扩展了S. islandicus的遗传工具箱，提升了其作为古菌合成生物学和工业生物技术平台的潜力。

图形摘要