利用乙醇作为唯一碳源，铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）能够高效发酵富含二鼠李糖脂的产品

《Food and Bioproducts Processing》：Efficient fermentation of di-rhamnolipids-rich products by P. aeruginosa using ethanol as solely carbon source

利用低成本乙醇（含工业废料）作为唯一碳源，通过分批发酵优化和连续21天串联分批发酵策略，实现了高价值生物表面活性剂脱脂乳糖脂的高效生产，产率达20.74g/L（批次5倍提升），累计产量117.78g/L，平均 productivity 0.234g/L/h（较优化批次提升117%），乙醇转化产物中85.6%为脱脂乳糖脂，性能与传统大豆油来源相当。

　　

刘星宇|罗丽|赵梦倩|张德宇|陈波|刘俊|龙旭伟

南京工业大学环境与生物工程学院，南京，210094，中国

摘要

高昂的原材料成本严重限制了鼠李糖脂在工业上相对于化学合成表面活性剂的竞争力。为了解决这一问题，我们开发了一种新的发酵工艺，使用低成本的乙醇（包括工业废弃物）作为唯一的碳源，由铜绿假单胞菌 PAO1进行发酵。通过分批优化，我们实现了20.74克/升的鼠李糖脂浓度——比批次发酵高出五倍。进一步实施连续分批发酵21天后，累计产量达到了117.78克/升，平均生产率为0.234克/升/小时（比优化后的分批发酵提高了117%）。重要的是，乙醇衍生的产品中含有85.6%的二鼠李糖脂——远高于传统系统——同时其性能与大豆油来源的产品相当。这项工作建立了一个可扩展且成本效益高的高价值生物表面活性剂生产平台，减少了对于昂贵底物的依赖，并实现了工业废弃物的再利用。

引言

表面活性剂是由两种不同成分组成的两亲分子：一个亲水极性基团和一个疏水链，它们协同作用以降低表面张力（Sarubbo等人，2022年）。表面活性剂被用作洗涤剂、溶剂或乳化剂，应用于石油、食品、制药和农业等多个领域（Wilson-Nieuwenhuis等人，2025年）。尽管基于石油化学的合成方法由于其成本效益目前主导着表面活性剂的生产，但传统表面活性剂由于其顽固的分子结构而带来了显著的环境挑战（Jiang等人，2020b年）。微生物生物表面活性剂作为一种可持续的替代品出现，由于其两亲结构源自可再生原料（如糖类、植物油）甚至工业或农业副产品，因此具有内在的可生物降解性和生态兼容性（Sonbhadra和Pandey，2025年；Thakur等人，2024年）。这些生物表面活性剂显示出与合成表面活性剂相当的界面活性，同时具有环保优势（Dobler等人，2016年；Yang等人，2023年）。

鼠李糖脂是最广泛研究的生物表面活性剂之一，主要由各种铜绿假单胞菌菌株（例如PAO1，ATCC 9027）使用植物油和糖作为碳源生产（Chong和Li，2017年；Invally等人，2019年；Zhang等人，2022年）。它们因其潜在的下一代生物表面活性剂特性而广受关注（Mohd Asmadi等人，2024年）。其受欢迎的原因在于其有趣的性质（如高表面活性、抗菌作用、改变扭动和群集现象以及可生物降解性），这些性质与绿色化学和循环经济的理念非常契合（Ren等人，2023年）。鼠李糖脂由一个或两个鼠李糖与β-羟基脂肪酸链连接而成。它们在许多行业中具有广泛的应用前景和巨大潜力（Dewidar等人，2022年；Jiang等人，2020b年；Liu等人，2018年）。尽管具有这些优势，鼠李糖脂相对于石油化学表面活性剂仍然相对昂贵（Luo等人，2024年；Sarubbo等人，2022年）。造成这种成本差异的因素有很多，尤其是对高价值底物的依赖（占总生产成本的30%以上）和小规模发酵（Ambaye等人，2021年；Radzuan等人，2017年）。

已经有许多努力来解决这些挑战，使鼠李糖脂在经济上更具可行性，例如通过培育高产菌株、优化培养条件、开发多种培养策略以及使用廉价的农业工业副产品（如废弃食用油、葡萄糖或甘油基残留物）作为唯一的碳源（Jiang等人，2020b年；Lan等人，2015年；Thakur等人，2024年）。在优化后的培养参数下，发酵液中的鼠李糖脂浓度最高可达80克/升，体积生产率约为1.54克/升/小时（Jiang等人，2021年）。然而，由于在强烈搅拌和通气条件下鼠李糖脂浓度的增加，生产规模的扩大受到严重泡沫问题的限制（Jiang等人，2020b年；Long等人，2017年）。严重的泡沫会大大降低生物反应器的工作效率（通常低于50%）。此外，过多的泡沫会导致产品、营养物质和细胞的损失，以及灭菌和污染问题（Jiang等人，2020b年；Long等人，2016年；Long等人，2017年）。

通常，泡沫控制是通过使用化学消泡剂或去泡剂来实现的（Denkov，2004年；Pugh，1996年）；然而，这种方法成本较高，并且由于鼠李糖脂产生的泡沫极其稳定，可能会对发酵和下游过程产生负面影响（Jiang等人，2020b年；Long等人，2016年）。此前在鼠李糖脂的发酵生产过程中曾使用乙醇作为消泡剂来控制严重泡沫（Sha等人，2012年）。此外，这种水溶性底物还可以作为鼠李糖脂发酵的唯一碳源（Matsufuji等人，1997年；Osman等人，1996年；Santos等人，2002年）。在这方面，使用工业废弃物乙醇作为鼠李糖脂生产的原料可以降低成本，并通过适当的喂养策略简化泡沫控制。然而，发酵产率仍不足以满足工业应用的需求。

在本研究中，乙醇被用作铜绿假单胞菌 PAO1发酵鼠李糖脂的唯一碳源，然后对培养基和发酵策略进行了优化以提高发酵水平。获得的鼠李糖脂随后进行了分析，并与使用大豆油作为碳源的传统发酵方法获得的鼠李糖脂进行了比较。最后，还验证了使用乙醇作为另一种生产菌株（铜绿假单胞菌 ATCC 9027）发酵鼠李糖脂的可行性。

材料与菌株

本研究中使用的乙醇（99%）购自南京圣建泉化学玻璃仪器有限公司。所有其他化学品（盐类、试剂等）均为分析级，从当地供应商处购买。铜绿假单胞菌 PAO1菌株（ATCC 15692?）和铜绿假单胞菌 ATCC 9027以冻干粉的形式从美国马里纳斯瓦斯的美国典型培养物保藏中心获得。

培养基

种子培养基（Jiang等人，2021年）由H₃PO₄（85%）（5毫升/升）、NaNO₃（4克/升）和MgSO₄（0.2克/升）组成

乙醇在发酵中的能力

虽然已经证明了基于乙醇的鼠李糖脂发酵的可行性（Sha等人，2012年），但其相关效率尚不清楚。在本研究中，通过批次发酵评估了鼠李糖脂的生产情况。鉴于NaNO₃和Fe²⁺是决定鼠李糖脂浓度的关键因素（Jiang等人，2021年；Soberón-Chávez等人，2005年），因此研究了它们对基于乙醇的发酵的影响。如图1A所示，随着NaNO₃的添加，鼠李糖脂浓度首先增加

结论

本研究确定了使用乙醇作为铜绿假单胞菌生产鼠李糖脂的可行性。在经过彻底优化的分批发酵过程中，鼠李糖脂的最大浓度达到了20.74克/升，是批次发酵所得浓度的五倍。此外，通过优化连续分批发酵，鼠李糖脂的生产率进一步提高。鼠李糖脂的总产量达到了117.78克/升，平均生产率约为

CRediT作者贡献声明

张德宇：方法学研究。陈波：监督、资源提供。刘俊：监督、资源提供。龙旭伟：写作——审稿与编辑、监督、资源提供、概念构思。刘星宇：写作——初稿撰写、可视化、验证、方法学研究、调查。罗丽：方法学研究。赵梦倩：方法学研究。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者衷心感谢中央高校基本科研业务费（编号30922010901）对本工作的财政支持。