环吡唑酸和黄曲霉素B1的毒理学评估：对斑马鱼发育和心脏生理的影响

《Food and Chemical Toxicology》：TOXICOLOGICAL ASSESSMENT OF CYCLOPIAZONIC ACID AND AFLATOXIN B1: EFFECTS ON ZEBRAFISH DEVELOPMENT AND CARDIAC PHYSIOLOGY

黄曲霉毒素B1和吡咯环酮酸对斑马鱼胚胎的协同毒性及其发育心脏毒性机制研究，发现联合暴露显著增强致死率和心脏功能抑制，证实斑马鱼胚胎模型在多毒素毒性研究中的有效性。

　　

维克托·卡戈特（Victor Kagot）| 玛尔特·德·博夫雷（Marthe De Boevre）| 汉娜·德·萨费尔（Hanna De Saffel）| 帕特里克·西普斯（Patrick Sips）| 林比卡尼·马图姆巴（Limbikani Matumba）| 希拉·奥科斯（Sheila Okoth）| 萨拉·德·塞格尔（Sarah De Saeger）| 安迪·威拉尔特（Andy Willaert）

比利时根特大学药学学院真菌毒素学与公共卫生卓越中心

摘要

黄曲霉素B1（AFB1）和环吡唑酸（CPA）等真菌毒素对健康构成严重威胁，但它们的联合毒性仍知之甚少。本研究首次探讨了AFB1和CPA对斑马鱼（Danio rerio）胚胎的单独及联合影响，重点关注发育和心脏方面的结果。胚胎在受精后6小时至4天内暴露于不同浓度的这两种毒素及其混合物中。高剂量下，AFB1会导致鳍部褶皱、胸鳍发育不良、身体弯曲和生长迟缓，并具有高致死性。CPA则会引起剂量依赖性的异常，包括脑出血、心包水肿、鳍部和身体畸形以及死亡率增加。联合暴露导致比单独暴露更严重的畸形，且死亡率显著升高，表明存在协同毒性。心脏评估显示，CPA单独作用主要降低心率、每搏输出量和心输出量，而AFB1单独作用对心脏功能无明显影响。然而，两者共同作用会进一步抑制心脏功能，显示出增强的心脏毒性。这些结果强调了CPA和AFB1共同暴露所带来的放大风险，并强调了在食品安全评估中考虑多种真菌毒素相互作用的重要性。该研究还进一步证实了斑马鱼胚胎作为真菌毒素毒性研究的体内模型的价值。

引言

真菌毒素是真菌的次级代谢产物，具有多种毒性作用，包括致突变性、致癌性、致畸性、雌激素样作用、神经毒性、免疫毒性，在某些情况下还具有急性致死性（Matumba等人，2021；Mir等人，2021）。虽然一些真菌毒素受到监管，但其他被归类为新兴真菌毒素的毒素尽管在食品和饲料中被检测到，却未得到常规监测（Gruber-Dorninger等人，2017）。在肯尼亚，多项研究记录了新兴真菌毒素的存在，尤其是在玉米中。例如，环吡唑酸（CPA）和黄曲霉素B1（AFB1）曾多次在多个家庭的玉米中被同时发现（Kagot等人，2022；Ngure等人，2021；Okoth等人，2018）。然而，关于这些新兴真菌毒素的毒理学数据，尤其是它们与受监管真菌毒素（如AFB1）的联合效应的数据仍然有限（Gallo等人，2021；Pérez-Fuentes等人，2021）。缺乏监管限制引发了人们对慢性暴露及潜在长期健康后果的担忧。

体外研究表明，CPA对人类CD34+单核细胞、THP-1细胞和Caco-2细胞具有细胞毒性，并可通过抑制单核细胞分化为巨噬细胞来损害免疫功能（Ostry等人，2018）。虽然AFB1被明确列为1类致癌物（Barany等人，2021；Li和Liu，2019），但其对发育和心脏的毒性作用了解较少。此外，关于CPA和AFB1之间潜在的协同或拮抗作用的数据也很缺乏。尽管体外模型提供了关于细胞效应的见解（如线粒体功能障碍、膜破坏和细胞凋亡（Juan-García等人，2020），但这些模型无法反映整个生物体内的复杂相互作用，从而限制了其对外推到人类和动物健康的影响（Truong等人，2011）。

斑马鱼（Danio rerio）模型提供了一个有价值的体内替代模型。其子宫外的透明胚胎发育过程允许直接、无创地观察生理过程（Juan-García等人，2020）。此外，斑马鱼与人类在基因上具有高度同源性，超过70%的人类基因在斑马鱼中有对应基因（Truong等人，2011）。它们的高繁殖能力使得能够获得大量样本，且胚胎培养所需体积小，非常适合进行毒性筛选（Juan-García等人，2020）。

本研究旨在评估AFB1、CPA及其混合物对斑马鱼胚胎的发育毒性、心脏毒性和致死性。通过研究形态异常、生长迟缓和心脏功能，我们填补了关于这些真菌毒素单独及联合效应的关键数据空白。这些发现有助于食品安全风险评估，并为未来的监管策略提供指导，特别是在主粮作物共污染较为普遍的地区。

斑马鱼饲养

所有实验均使用野生型AB型斑马鱼。鱼类饲养在半封闭的循环系统中（ZebTec，Tecniplast，意大利），位于根特大学的斑马鱼设施（ZFG）。水质pH值维持在7.5，电导率约为500 μS，系统温度保持在27–28°C，光照周期为14小时/10小时黑暗。鱼类每天喂食干饲料（Gemma Micro，Skretting，英国）和微小卤虫（Ocean Nutrition，比利时），具体喂养方法参见Bek的描述。

范围测定实验

在进行毒性测试之前，首先进行了范围测定实验，以确定AFB1、CPA及其联合暴露的LC₁₀₀（导致100%死亡率的浓度）。所选浓度基于肯尼亚受污染玉米中的实际检测水平。据报道，同一样本中的总黄曲霉素含量高达558μg/kg，其中AFB1通常占总黄曲霉素含量的约80%（Kagot等人，2022；Ngure等人，2021）。

讨论

本研究首次探讨了斑马鱼胚胎模型中黄曲霉素B1（AFB1）和环吡唑酸（CPA）的联合暴露，分别评估了它们的发育和心脏毒性效应。这两种真菌毒素均表现出剂量依赖性的发育毒性，但其作用的时间、范围和性质有所不同。CPA暴露引起的异常更为广泛，尤其是对心脏功能的影响更为显著。

作者贡献声明

安迪·威拉尔特（Andy Willaert）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、监督、资源协调、方法学设计、实验实施、数据分析、概念构思。 希拉·奥科斯（Sheila Okoth）：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、监督、资源协调、方法学设计。 萨拉·德·塞格尔（Sarah De Saeger）：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、监督、资源协调、项目管理、资金筹集、概念构思。 维克托·卡戈特（VICTOR KAGOT）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化。

未引用参考文献

Azman等人，2020；Dey和Kang，2020。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突。

致谢

作者感谢根特大学特别研究基金（BOF 01W02217）和根特大学全球思维基金（GMF SRS.2023.0001.01）的财政支持。同时，也非常感谢根特大学医院“斑马鱼核心设施”工作人员的技术支持。