综述：空间组学：在肿瘤微环境分析中的应用与价值

《Cancer and Metastasis Reviews》：Spatial omics: applications and utility in profiling the tumor microenvironment

本综述系统阐述了空间组学（Spatial Omics）这一变革性技术在生物医学研究，尤其是癌症研究中的应用现状与前景。文章重点介绍了测序基础（如Visium、Stereo-seq）和成像基础（如MERFISH、Xenium）两大类技术平台，及其在解析肿瘤微环境（TME）、肿瘤异质性、肿瘤-免疫相互作用等方面的独特优势。作者展望了人工智能（AI）驱动分析、标准化及临床转化等未来方向，强调空间组学将在精准肿瘤学（Precision Oncology）中扮演核心角色，为理解肿瘤生物学和制定个体化治疗策略提供深层见解。

　　

空间组学技术导论

空间组学技术已经发展成为生物医学研究领域的一项变革性工具。与传统的大量（Bulk）或单细胞（Single-cell）测序方法相比，其最大优势在于能够保留组织的空间结构，使研究人员能够将分子信息直接映射到组织学结构上。传统基因组方法，如大量RNA测序，虽然在分析RNA以推断整体组织特征方面发挥了重要作用，但缺乏空间分辨率，限制了其识别特定转录本在组织架构中起源位置的能力，并阻碍了对原位细胞相互作用的理解。单细胞转录组学的出现标志着一大进步，它使得在单个细胞水平解析转录组成为可能，允许对细胞状态和类型进行更精细的分类，并为理解细胞间动力学提供了新见解。然而，尽管具有这种粒度，单细胞方法仍无法明确解析空间背景或确认原生组织环境中细胞间的物理相互作用。

空间转录组学技术正是为了弥合这一差距而开发的。初始方法如激光捕获显微切割（Laser-capture Microdissection）和靶向区域特异性RNA测序使得在限定组织区域内进行转录组分析成为可能，但在通量和可扩展性方面受限。测序基础平台的商业发布通过标准化拓宽了空间分辨转录组学的应用范围。

测序基础的空间组学

测序基础的空间转录组学将单细胞RNA测序的核心原理应用于空间分辨的组织，从而能够在完整的组织切片上进行全转录组范围的分析。这些方法依赖于空间索引的表面——例如带有条形码的玻片（如10x Genomics Visium）、图案化的DNA纳米球阵列（如BGI Stereo-seq）或带有条形码的磁珠（如Curio Slide-seq）——以空间信息明确的方式捕获RNA分子。将组织切片放置在这些表面上后，使用与阵列上已知位置对应的条形码寡核苷酸捕获mRNA。经过逆转转录和文库制备后，测序读数被映射回参考基因组及其原始空间坐标。这使得无需靶基因先验知识即可对大面积组织进行无偏倚、高通量的转录组分析。其结果是一幅丰富的基因表达空间图谱，既保留了解剖学背景，又提供了单细胞或近细胞级的分辨率。像GeoMx数字空间分析仪（结合测序与区域特异性分析）和DBiT-seq（使用流体输送条形码，允许进行多模态空间分析 assay，如RNA、蛋白质和表观基因组学）这样的平台进一步扩展了测序基础方法的实用性。这些技术共同使测序基础的空间组学成为癌症、神经生物学和发育生物学中驱动发现研究的强大工具。

成像基础的空间转录组学

成像基础的空间转录组学多重分析技术（如ISH, ISS）利用迭代的杂交和高分辨率荧光成像循环，在完整组织内定位RNA分子。这些方法需要靶转录本的先验知识，因为它们依赖于设计特定的、带有条形码的寡核苷酸探针，这些探针与选定的mRNA种类杂交。在每个杂交循环后，荧光成像捕获结合探针的空间位置，然后通过连续的成像轮次对信号进行解码，以重建转录本的身份和丰度。像MERFISH（多重容错荧光原位杂交）和SMI（空间分子成像）这样的平台利用组合条形码方案来增加多重分析能力，同时最大限度地减少成像错误。这些方法能够以亚细胞分辨率同时检测全转录组中数百至数千个转录本，为基因表达模式和细胞邻域的精细结构提供见解。

基于ISS的平台，如Xenium，通过将组织内的RNA逆转录成cDNA、连接padlock探针、滚环扩增和荧光测序连接反应，实现了对RNA序列的直接读取，为ISH-only方法提供了替代方案。成像基础转录组学的一个显著优势是保留了组织结构和单细胞空间分辨率，这对于解析肿瘤边缘、免疫细胞生态位和发育梯度等细粒度结构特别有价值。这些技术非常适用于空间精度至关重要的假设驱动型和探索型研究。

成像基础的空间蛋白质组学

成像基础的空间蛋白质组学利用与转录组分析 assay 相似的原则，但侧重于检测和空间映射组织中的蛋白质表达。这些方法使用与荧光标签或独特寡核苷酸条形码结合的抗体或亲和试剂，然后通过迭代成像或测序基础方法进行解码。顺序免疫荧光（seqIF-COMET）和其他循环免疫荧光（CycIF）方法通过执行重复的染色、成像和信号去除轮次，对同一组织切片中的多达100种蛋白质靶点进行分析，扩展了传统的免疫组织化学。最广泛使用的平台之一CODEX（通过索引共检测）依赖于抗体偶联的DNA条形码，通过与互补荧光报告分子进行重复的杂交循环进行可视化。每个成像轮次显示一部分蛋白质，经过多个循环后，可以在整个组织上重建高度多重化的蛋白质表达图谱。

其他平台，如MIBI（多重离子束成像）和IMC（成像质谱流式细胞术），使用金属同位素标记的抗体和飞行时间质谱来并行检测数十种蛋白质，提供了卓越的多重分析能力，而无需担心荧光系统中光谱重叠的限制。这些技术在肿瘤学中特别强大，因为空间分辨的免疫分析和肿瘤异质性对于理解疾病机制和治疗反应至关重要。

蛋白质组分析 assay 通常与转录组空间数据整合，以提供更全面的、多模态的组织组织和细胞表型视图。虽然蛋白质组学本质上受到抗体可用性和特异性的限制，但抗体验证和新多重化学技术的进步不断扩大靶标面板。成像基础蛋白质组学还受益于高空间保真度，使其成为在细胞-细胞接触和组织微环境水平绘制蛋白质表达图谱的理想选择。

空间数据分析的计算方法

空间组学技术生成大规模、高维度的数据，这些数据结合了转录组和/或蛋白质组谱与空间坐标，因此需要专门的计算方法进行分析。分析流程通常从预处理步骤开始，如图像配准、组织分割和空间条形码解复用，以将分子计数与空间位置或单个细胞关联起来。对于测序基础平台（如Visium、GeoMX、DBit-seq或Slide-seq），这涉及将测序读数与参考基因组比对并将转录本映射到空间条形码；对于成像基础平台，使用图像配准和点解码来识别转录本位置。对于大多数空间分析 assay，包括成像基础的转录组学和蛋白质组学，细胞分割是成像基础分析中的关键组成部分，需要使用DAPI染色或膜标记物精确划分细胞边界，这通常得到深度学习算法（如Cellpose、Stardist）的支持。

一旦分子特征被分配到空间单元（细胞、点或像素），就会使用降维技术，如主成分分析（PCA）、均匀流形近似与投影（UMAP）或t分布随机邻域嵌入（t-SNE）来可视化细胞异质性。聚类方法——如Leiden或Louvain——根据转录组相似性对细胞或区域进行分组，而具有空间意识的算法（如BayesSpace、SpaGCN或stLearn）将空间邻近性整合到聚类中以保留局部结构。为了注释细胞类型，基于参考的标签转移方法（如Seurat的锚点基础整合、Tangram或InsitutypeML）利用现有的单细胞RNA-seq图谱，根据转录相似性和空间一致性来推断身份。

除了聚类，空间转录组学支持独特的下游分析，包括使用SpatialDE、Trendsceek或SPARK等工具推断空间可变基因。这些基因有助于定义解剖结构、肿瘤边界或微环境生态位。此外，配体-受体相互作用推断工具，如NicheNet、CellPhoneDB和Giotto的空间相互作用模块，通过将空间共定位纳入信号模型，能够预测细胞间通讯。适用于空间背景的轨迹推断方法（例如，带有空间锚定的Monocle 3或空间伪时间模型）可以揭示跨组织景观的发育或病理梯度。

虽然这些计算工具已经显著推进了空间组学分析，但它们依赖于不同的假设，这些假设会影响其性能和解释。例如，统计模型如SpatialDE和SPARK假设平滑的空间变异，这可能无法完全捕捉异质性组织（如肿瘤）中的突然转变。基于图的方法如SpaGCN和BayesSpace能更有效地建模空间拓扑结构，但对图构建参数和分辨率尺度敏感。类似地，基于参考的映射框架如Tangram和InsitutypeML严重依赖于单细胞参考图谱的质量和稳健性，可能在表征不良的组织区域中包含有偏见的细胞类型注释。这些考虑强调了需要仔细选择工具，平衡可解释性、稳健性和生物学相关性。

最近出现的集成框架通过结合多个空间层和更全面地建模细胞间关系来解决这些局限性。SiGra和xSiGra采用图神经网络来整合空间转录组学和蛋白质组学信息，揭示潜在的空间域和高阶细胞相互作用。SpaCI利用空间基因表达与推断的细胞间通讯网络来捕捉上下文依赖的信号传导。这些方法代表了向多模态、预测性空间组学分析的转变，扩展了其分析深度和转化潜力。

可视化对于解释空间组学数据至关重要，并得到Squidpy、Giotto、Napari和Vitesse等平台的支持，这些平台提供交互式空间图、表达叠加和邻域图可视化。随着数据复杂性的增加——特别是3D空间数据或多组学整合——可扩展、可解释且基于生物学的计算框架对于充分利用空间组学的力量将至关重要。

空间组学技术在癌症研究中的应用

空间组学最有效地应用于需要详细分析细胞活动的领域。在癌症中，空间组学可用于在单细胞和亚细胞水平绘制肿瘤微环境（TME）图谱，揭示生物标志物表达的空间分布以及各种细胞类型（包括癌细胞、免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞）的相互作用。这对于理解TME如何支持肿瘤进化、转移和免疫逃逸，以及识别潜在的治疗靶点至关重要。

在2023年，Xia等人通过结合空间组学与单细胞转录组学，证明了空间组学对于理解原发性中枢神经系统淋巴瘤（PCNSL）的TME的重要性，能够生成高分辨率的TME图谱以确定细胞组成和空间位置。空间组学独特地揭示了免疫细胞和肿瘤细胞在PCNSL TME内是如何组织和相互作用的——特别是传统单细胞或大量分析无法检测到的位置依赖性免疫抑制和信号模式。该研究确定了不同的肿瘤亚群，如“防御者”、“攻击者”和“侵略者”，说明了免疫细胞浸润对肿瘤行为的影响，为基于TME特征的靶向治疗提供了见解。另一个典型例子是Croizer等人的研究，他们绘制了TME图谱，表征了FAP⁺癌症相关成纤维细胞（CAF）的多样性和可塑性，并确定了10种CAF相关的生态细胞类型（EcoCellTypes）。这种整合单细胞和空间组学的方法揭示了不同的CAF簇如何与免疫细胞和癌细胞相互作用，提供了对TME组织的更深入理解，并提出了靶向FAP⁺ CAF以增强免疫治疗疗效的潜在策略。免疫抑制性myCAF簇以及免疫抑制性巨噬细胞（TREM2⁺ TAM）和调节性淋巴样细胞（FOXP3⁺ Tregs, NKG2A⁺ NKregs）始终被发现与肿瘤细胞紧密相邻。这些空间模式——基于距离的细胞簇分离和生态细胞类型富集——与患者结局相关。这些研究表明，空间组学超越了传统的批量或单细胞分析，能够在空间背景下理解TME内的细胞身份和相互作用。空间信息使研究人员不仅能理解每个细胞的作用，还能了解它们在哪里以及如何相互通信，为更深入地理解癌症行为和治疗反应提供了关键见解。

除了结构和细胞图谱绘制，空间组学还能捕捉治疗引起的组织及周围TME的变化，提供对药物作用的流行病学理解，有助于在单细胞水平评估药物疗效和机制。SpaRx模型通过将药物基因组学与CosMx和MERSCOPE数据相结合，探索了非小细胞肺癌（NSCLC）和肝细胞癌（HCC）等疾病的治疗反应。这种方法揭示了空间上不同的药物反应模式，例如在肺癌中分散的顺铂敏感细胞和成簇的耐药细胞，以及在肝癌中核心定位的耐药细胞。通过识别癌症内空间相关的区域，SpaRx揭示了耐药机制，从而实现个性化治疗策略，并促进了跨多种癌症的靶点验证、生物标志物发现和药物再利用。这些发现表明，空间组学增强了对机制的理解，并作为一个转化桥梁，将分子见解与临床表型和药物反应变异性联系起来。这种对不同肿瘤区域内TME分子异质性的高分辨率分析，允许在单个肿瘤内识别不同的癌细胞亚型，为肿瘤进展、耐药性和转移潜力提供见解。一项关于胰腺导管腺癌（PDAC）瘤内异质性的研究强调了空间基因表达对肿瘤行为和治疗结果的影响。Sun等人绘制了缺氧和常氧肿瘤区域的空间基因表达图谱，发现缺氧诱导了肿瘤细胞亚群的显著变化，这些变化增加了耐药性并促进了侵袭，尤其是在缺氧区域。这项研究强调了靶向缺氧相关通路（如糖酵解）的潜力，并确定PI3K抑制剂作为使用空间组学作为发现工具识别出的缺氧区域的潜在治疗药物。这项研究强调，空间背景揭示了TME特异性的脆弱性，这对于设计靶向干预措施至关重要。将这种方法扩展到早期肺腺癌（LUAD），最近的一项研究揭示了贴壁型和腺泡型亚型的独特分子特征，包括具有预后意义的亚型特异性基因特征。空间分析进一步揭示，腺泡区域中的PD-L1⁺内皮细胞通过抑制CD8⁺ T细胞浸润，促进了免疫逃逸和肿瘤进展。在高度异质性的肿瘤中，空间组学分析提高了诊断准确性，这在两种罕见的乳腺癌亚型——claudin-low（CL）和化生性乳腺癌（MpBC）的研究中得到了证明。通过对11个三阴性肿瘤（包括3个CL和4个MpBC样本）进行空间组学分析，Coutant等人尽管存在基质污染，仍识别出了如BMPER、POPDC3和SH3RF3等肿瘤特异性标志物。这些结果揭示了在这些高可塑性肿瘤中进行批量分子谱分析的局限性，并证明了空间方法在改进亚型分类和制定治疗策略方面的价值。在起源于浆液性输卵管上皮内癌（STIC）的高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）中，Wang等人通过使用测序基础的空间组学，研究了早期疾病进展，确定了IGFBP2——一个在STIC中因其原生微环境中DNA低甲基化而上调的关键基因。通过空间映射上皮细胞及其相邻基质，他们证实IGFBP2在绝经后输卵管中促进肿瘤细胞增殖，而敲低IGFBP2通过阻断AKT通路抑制肿瘤生长，提示了早期癌症发展的潜在机制及其治疗靶点潜力。总体而言，空间组学作为一种转化工具具有巨大潜力，可以指导精准肿瘤学和靶点发现，不仅通过绘制跨肿瘤的分子和细胞异质性图谱，还通过提供关于药物反应、耐药性和肿瘤进展在单细胞分辨率下的机制见解。

空间组学已成为分析免疫细胞浸润和肿瘤-免疫相互作用的创新工具，为免疫治疗的发展提供了重要见解。Cai等人比较了导管原位癌（DCIS）和浸润性导管癌（IDC），证实了在乳腺癌进展过程中肿瘤侵袭性增加和免疫逃逸。空间伪时间组学分析表明，在IDC中观察到致癌通路的激活和更高的拷贝数变异，并且T细胞通过共抑制相互作用（如NECTIN2-TIGIT）转变为耗竭状态。这些发现证明了肿瘤-免疫相互作用如何塑造免疫抑制性TME。随着免疫检查点抑制剂（ICI）的成功日益增加，理解肿瘤-免疫相互作用变得更为关键。空间组学通过揭示免疫细胞分布和肿瘤-免疫相互作用如何影响治疗结果，对于解释免疫检查点抑制剂的反应已变得不可或缺。Iwasa等人通过空间组学确定了口腔鳞状细胞癌（OSCC）对免疫治疗获得性耐药的机制。通过比较免疫治疗前后的肿瘤和TME样本，作者发现从免疫相关通路向表观遗传通路的转变，包括PRMTs、EZH2、HDACs和DNMT1的活性增加。这些变化与MHC I类表达降低和抗原呈递受损相关，显示了表观遗传抑制剂与免疫治疗联合克服耐药性的可能性。另一项研究应用空间组学来表征头颈部血管肉瘤（一种与紫外线暴露相关的罕见肿瘤类型）的免疫景观。通过将空间数据与基因组和转录组分析整合，Loh等人发现了拓扑异质性，包括免疫“热”肿瘤（炎症被排除在肿瘤区域外）和免疫“冷”肿瘤（含有炎症灶）。这些发现揭示了免疫浸润的空间复杂性，并表明空间分析可以提高血管肉瘤免疫治疗策略的准确性。这些研究表明，空间组学提供了关于免疫细胞的空间组织和肿瘤-免疫相互作用如何影响免疫治疗结果的机制见解，使得能够识别可操作的靶点并设计更精确和针对特定背景的免疫治疗策略。

空间组学通过提供对肿瘤生物学的整体视角，能够识别特定的分子特征并指导精准医疗。通过绘制不同肿瘤区域对治疗的反应图，空间组学可以指导选择适合个体患者的靶向治疗。Wang等人使用空间组学方法绘制了92名三阴性乳腺癌（TNBC）患者的肿瘤结构和TME，确定了与临床结局相关的九种空间原型。该研究揭示了独特的分子和免疫特征，包括一个预测免疫治疗反应的新型三级淋巴结构（TLS）基因特征，强调了空间分析在完善TNBC分类和指导个性化治疗策略方面的价值。空间组学还可以通过揭示在肿瘤或TME的特定区域哪些基因和通路被激活来帮助识别新的药物靶点。这有助于指导开发旨在破坏TME或癌细胞中促癌信号的靶向治疗。Arora等人对HPV阴性口腔鳞状细胞癌（OSCC）进行了一项研究，使用空间组学揭示了肿瘤核心（TC）和前沿（LE）之间不同的基因表达和细胞谱。LE特征与侵袭性和不良预后相关，并在多种癌症中保守，而TC特征与较好的结局相关。该研究还表明，能够逆转LE样状态的药物可以改善治疗，提示空间组学可以精确地将LE识别为一个有希望的治疗靶点。Vahid等人对102名非小细胞肺癌（NSCLC）患者的肿瘤和基质区室进行了空间蛋白质组学分析，以识别与总生存率相关的蛋白质特征。这项研究表明，基质CD56表达与更好的生存相关，而肿瘤B细胞淋巴瘤超大（BCL-xL）和B7-H3与较差的结局相关。这些结果提示了空间组学在NSCLC中发现预后生物标志物和开发靶向治疗的可能性。空间组学超越了简单的分子特征分类，将空间分析的分子信息转化为适用于精准医疗的见解。通过系统地将特定分子特征与肿瘤结构、免疫环境和临床结局联系起来，空间组学增强了个性化治疗策略，并突出了先前未知的预后因素和治疗靶点。

空间组学技术通过实现对肿瘤结构和细胞相互作用的高分辨率洞察，正在改变癌症研究。随着这些技术从简单的图谱绘制工具演变为集成平台，它们揭示了肿瘤生物学的核心功能特征——如亚克隆进化、免疫逃逸、代谢适应和治疗耐药——与空间组织密切相关。通过捕捉这些空间分辨的过程，空间组学建立了一个概念框架，将分子改变与其在肿瘤微环境内的空间和功能后果联系起来。该框架支持用于精准肿瘤学和早期诊断的空间表观遗传学分析，使得能够合理设计个性化治疗策略。这些应用正在重塑我们对肿瘤生物学的理解，并加速将空间见解转化为临床实践。

空间组学在癌症研究中未解决的问题与挑战

尽管空间组学显著增进了我们对癌症的理解，但仍存在一些挑战和未解决的问题，阻碍了其在癌症研究和临床应用中的全部潜力。当前空间组学平台的一个主要技术挑战是其有限的分辨率，尤其是在区分单个细胞方面。对于这些应用，由于并非在单个细胞水平上分配，因此准确分离基因活动在计算上变得具有挑战性，并限制了对癌症研究至关重要的细胞异质性分析。高分辨率成像基础转录组方法提供了更高的分辨率，但在规模和基因覆盖范围上有限，并且需要预定义的探针面板，这可能会限制新转录本或稀有细胞群的发现。开发能够平衡高分辨率、全面转录组覆盖范围（最近由CosMX平台实现）和可扩展性的平台仍然是一个重大挑战，尤其是在研究稀有细胞群空间分布很重要的肿瘤时。测序基础和成像基础方法在可用形态学标记物的范围上都有限制。增加用于染色的经过验证的抗体可以缓解与区分重要细胞类型相关的挑战。组织降解和载玻片粘附问题也是所有空间组学分析 assay 面临的技术挑战。许多未经验证的组织类型可能需要额外的组织优化，当样本供应有限时，这可能会有问题。较小的组织块，例如组织微阵列（TMA）中的组织块，在组织处理过程中更容易从载玻片上脱落，导致样本丢失。

另一个挑战是空间组学与其他组学数据的整合。肿瘤的形成有多种原因，