缺氧诱导的USP13通过稳定ACLY驱动肝细胞癌铁死亡抵抗和肿瘤免疫逃逸

《Cell Death Discovery》：Hypoxia-induced USP13 expression drives ferroptosis resistance and tumor immune evasion in hepatocellular carcinoma through the stabilization of ACLY

本研究针对肝细胞癌(HCC)预后差、治疗抵抗等临床难题，揭示了缺氧微环境通过HIF-1α/USP13/ACLY轴促进胆固醇代谢重编程的新机制。研究人员发现USP13抑制剂2-甲氧基雌二醇(2-Met)可有效诱导铁死亡、增强CD8+ T细胞毒性，证实靶向USP13通过去泛素化稳定ACLY蛋白，为联合免疫治疗提供了新靶点。该成果发表于《Cell Death Discovery》，为改善HCC治疗效果提供了理论依据。

　　

肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是全球最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，占所有肝癌病例的90%以上。这种癌症以其侵袭性强、进展迅速和高复发率为特征，导致患者临床预后极差。尽管手术切除、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等手段不断进步，晚期肝细胞癌的治疗选择仍然有限，患者五年生存率低于15%。因此，开发更有效的治疗策略成为当前肝癌研究领域的迫切需求。

在细胞生命活动中，泛素化(ubiquitination)作为一种重要的蛋白质翻译后修饰，通过泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)的级联反应，精确调控着细胞周期进程、细胞凋亡、DNA修复和蛋白质降解等关键过程。而与泛素化过程相反，去泛素化酶(deubiquitinating enzymes, DUBs)则能够移除靶蛋白上的泛素分子，逆转泛素化信号，为细胞功能调控提供了另一层精细的调控机制。在人类基因组中，大约编码有100种去泛素化酶，根据其序列和催化结构域可分为6个家族。

近年来，去泛素化酶在肿瘤发生发展中的作用日益受到关注。其中，泛素特异性蛋白酶13(ubiquitin-specific protease 13, USP13)因其在调控癌症相关细胞过程中的重要作用而成为研究热点。2-甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol, 2-Met)作为一种从天然化合物库中筛选出的USP13抑制剂，已在非小细胞肺癌、卵巢癌等肿瘤中显示出良好的抗肿瘤效果，但其在肝细胞癌中的具体作用和机制尚不清楚。

铁死亡(ferroptosis)是近年来发现的一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，以铁依赖性脂质过氧化物的致死性积累为特征。研究表明，铁死亡在肿瘤抑制中扮演着重要角色，为癌症治疗提供了新的思路。同时，胆固醇代谢与铁死亡敏感性之间存在密切联系，而肿瘤微环境中的胆固醇水平也直接影响着CD8⁺ T细胞的功能状态。然而，这些过程在肝细胞癌中的具体调控机制仍有待阐明。

针对这些科学问题，中南大学湘雅医院的研究团队在《Cell Death Discovery》上发表了最新研究成果，系统揭示了缺氧诱导的USP13表达通过稳定ATP柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase, ACLY)驱动肝细胞癌铁死亡抵抗和肿瘤免疫逃逸的作用机制。

主要技术方法

本研究综合利用了多种前沿技术方法：采用患者来源类器官(Patient-derived organoids, PDOs)模型和肝癌细胞系进行体外功能验证；通过免疫共沉淀联合质谱分析(Co-IP/MS)筛选USP13相互作用蛋白；利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析肿瘤免疫微环境特征；建立C57BL/6小鼠异种移植瘤模型和DEN诱导的原发性肝癌模型进行体内功能验证；通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)代谢组学分析胆固醇代谢变化；采用流式细胞术检测脂质活性氧(lipid ROS)、谷胱甘肽(GSH)水平和免疫细胞浸润情况。

研究结果

靶向USP13抑制肝细胞癌进展

研究人员首先评估了USP13抑制剂2-Met在肝细胞癌中的抗肿瘤效果。通过6例患者来源类器官模型验证发现，2-Met处理显著降低了类器官的细胞活力，Calcein AM/PI染色和结晶紫染色结果均显示2-Met处理组细胞死亡增加。临床样本分析表明，USP13在肝癌组织中高表达，且与患者不良预后显著相关。代谢组学分析显示，2-Met处理引起了胆固醇代谢通路的显著改变，提示胆固醇代谢可能参与USP13介导的肿瘤促进作用。

USP13驱动细胞增殖、干性和胆固醇代谢同时抑制铁死亡

进一步的机制研究表明，2-Met处理显著抑制了LM3和Hep3B肝癌细胞的增殖能力、克隆形成能力和肿瘤球形成能力。同时，2-Met显著降低了细胞内的胆固醇和胆固醇酯水平。在铁死亡研究方面，2-Met增强了铁死亡诱导剂RSL3的敏感性，这种效应可被铁死亡抑制剂Ferrostatin-1逆转。2-Met处理还导致脂质ROS水平升高、GSH水平降低以及铁离子浓度增加。通过直接敲低USP13基因验证了类似表型，证实了USP13在调控胆固醇代谢和铁死亡中的关键作用。

USP13介导肝细胞癌中T细胞功能

通过分析公共单细胞RNA测序数据集，研究人员发现USP13高表达肿瘤中T细胞浸润显著减少，且浸润T细胞中CD8、颗粒酶B(Granzyme B, GZMB)和干扰素γ(IFN-γ)表达降低。体外共培养实验表明，2-Met处理的肝癌细胞对T细胞介导的杀伤作用更加敏感，同时促进了CD8⁺ T细胞分泌GZMB和IFN-γ。动物实验进一步证实，2-Met治疗显著抑制了肿瘤生长，增加了肿瘤内CD8⁺ T细胞浸润，并提高了T细胞中GZMB和IFN-γ的表达水平。机制上，USP13通过调控胆固醇代谢影响CD8⁺ T细胞功能，胆固醇补充可逆转USP13缺失诱导的T细胞功能增强。

USP13直接结合并稳定ACLY

为阐明分子机制，研究人员通过免疫共沉淀-质谱分析发现USP13与ACLY存在直接相互作用。免疫共沉淀和免疫荧光实验证实了内源性USP13与ACLY在细胞质中的共定位。结构域分析表明，USP13的USP和UBA结构域与ACLY的CoA连接酶结构域直接结合。功能实验显示，USP13缺失降低了ACLY蛋白水平但不影响其mRNA表达，且这种效应可被蛋白酶体抑制剂MG132逆转。USP13通过其去泛素化活性特异性清除ACLY上K48连接的多聚泛素链，延长ACLY蛋白半衰期。定点突变实验进一步确定K726是USP13去泛素化ACLY的关键位点。

缺氧诱导的USP13表达通过ACLY促进HCC进展

机制上，研究人员发现缺氧微环境是驱动USP13高表达的重要因素。TCGA数据分析显示HIF-1α与USP13表达呈正相关。启动子分析和荧光素酶报告基因实验证实HIF-1α通过结合USP13启动子的Region#2区域转录激活USP13表达。缺氧条件或HIF-1α过表达可诱导USP13和ACLY的上调，而USP13敲低则消除了缺氧诱导的ACLY上调和稳定性增加。挽救实验表明，外源性过表达ACLY可逆转USP13缺失诱导的抗肿瘤效应。

研究结论与意义

本研究系统揭示了缺氧-HIF-1α-USP13-ACLY信号轴在肝细胞癌中的重要作用。在肝癌特有的缺氧微环境中，HIF-1α转录激活USP13表达，升高的USP13通过去泛素化稳定ACLY蛋白，进而促进胆固醇代谢重编程。这一过程不仅增强了肝癌细胞对铁死亡的抵抗能力，还通过改变肿瘤微环境中的胆固醇代谢抑制CD8⁺ T细胞的功能，最终导致肿瘤免疫逃逸。

该研究的创新性在于首次将缺氧信号、去泛素化修饰、代谢重编程和免疫调控等多个重要生物学过程有机整合，阐明了USP13在肝细胞癌中同时调控铁死亡敏感性和抗肿瘤免疫的双重功能。研究结果表明，靶向USP13不仅能够直接诱导肿瘤细胞铁死亡，还能增强T细胞介导的抗肿瘤免疫反应，为肝细胞癌的治疗提供了新的联合治疗策略。特别是USP13抑制剂2-甲氧基雌二醇在临床前研究中展现出的良好抗肿瘤效果，为其进一步的临床转化应用奠定了理论基础。

这项研究不仅深化了对肝细胞癌发病机制的理解，也为开发针对肿瘤代谢-免疫交叉对话的新型治疗策略提供了重要线索，具有重要的理论意义和临床转化价值。