基于SERS技术的适配传感器，利用Au纳米颗粒@Ag纳米颗粒/磁性氧化石墨烯组装体实现大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的同时检测

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：SERS-based Aptasensor using Au NSs@Ag NPs/magnetic graphene oxide assemblies for simultaneous detection of Escherichia coli and Staphylococcus aureus

基于表面增强拉曼散射（SERS）和磁石墨烯氧化物（MGO）的多重病原体检测平台构建成功，通过金纳米星@银核壳复合物负载ATP/NTP Raman探针与双aptamer系统实现大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的高灵敏度同步检测（检测限16-20 CFU/mL），磁分离增强样本富集效果，为食品安全提供新策略。

　　

冯蓉|郭星蕾|张建豪|严文静

中国重庆市永川市重庆市职业学院

摘要

快速同时检测多种食源性病原体对公共卫生和食品安全至关重要。本文构建了一种高灵敏度的表面增强拉曼散射（SERS）适配体传感平台，该平台利用标记有拉曼报告剂的金纳米星@银核壳纳米粒子（Au NSs@Ag NPs）和适配体功能化的磁性氧化石墨烯（MGO），用于同时检测大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）。这些材料（Au NSs@Ag NPs和MGO）经过特定适配体的修饰，Au NSs@Ag NPs还负载了不同的拉曼报告剂（ATP和NTP）作为SERS探针。在目标细菌存在的情况下，通过Au NSs@Ag NPs与适配体在MGO表面的识别作用形成夹心复合物，从而实现高效的磁分离和富集。基于Au NSs@Ag NPs的独特SERS峰，可以同时定量这两种目标细菌。由于Au NSs@Ag NPs的强SERS增强效应和MGO的优异富集能力，该方法在同时定量这两种病原体方面表现出优异的性能。SERS强度与细菌浓度对数呈良好线性关系，检测限分别为E. coli 16 CFU/mL和S. aureus 20 CFU/mL。这项工作为多重病原体检测提供了一种稳健且高效的方法，在实际食品样本应用中具有巨大潜力。

引言

细菌感染仍然是对公共卫生的重大威胁，是全球疾病和死亡的主要原因之一[1,2]。对于大多数致病菌来说，早期及时有效的诊断可以显著提高患者的生存率，减少抗生素的滥用，并降低抗生素耐药性[3]。因此，迫切需要一种能够在超低水平下快速、灵敏且准确地检测致病菌的方法，并具备多重检测能力，以便从少量样本中获取更多信息，从而降低成本[4]。

传统的细菌培养是细菌检测的金标准，具有高准确性，但需要复杂的生化分析过程，耗时数天，并且需要受过高度训练的人员[5]。因此，已经开发了其他方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）[6]、聚合酶链反应（PCR）[7]、电化学[8]和荧光[9]。其中，PCR可以在几小时内实现致病菌的多重检测，但需要预先分离细菌DNA、准备酶反应混合物和进行核酸扩增，这限制了其在即时诊断中的应用[10]。

表面增强拉曼散射（SERS）作为一种有前景的分析工具，能够将吸附在金属表面的分子的拉曼信号增强高达10^14倍，实现单分子检测[11, [12], [13], [14]]。更重要的是，SERS提供了具有窄峰（约1 nm）的独特分子指纹信息，使其比荧光光谱（50 nm）更适合多重分析[15,16]。SERS已在生物医学[17]、临床诊断[18]、环境监测和食品安全领域得到广泛应用[19,20]。然而，由于环境中的复杂基质，通过纳米粒子聚集来检测SERS信号增强常常受到阻碍。为了实现高特异性、灵敏度和多重检测，已经开发了结合金属纳米粒子（NPs）和特定有机拉曼报告剂的SERS标签[21]。这些具有强拉曼信号的SERS活性纳米探针能够更有效地检测具有相似SERS光谱的不同细菌种类，并有效避免复杂基质的干扰[22]。

金属纳米粒子-拉曼报告剂代表了SERS标签的最简单结构。由于金属表面的局部光学场，金属纳米粒子可以显著增强吸附分子的光谱信号，为这些标签提供了坚实的基础[23], [24], [25]]。然而，简单的金属纳米粒子-拉曼报告剂结构往往缺乏稳定性，信号容易受到环境干扰。将拉曼活性分子封装在银壳和金核之间已被证明是制备SERS标签的有效方法[26]。通过调节表面等离子体共振（SPR）波长以匹配给定激光激发波长，双金属金-银（Au@Ag）核壳纳米粒子可以实现最强的SERS增强[27]。目前，已经开发了多种用于SERS检测的Au@Ag核壳纳米粒子，包括Au NP@Ag NPs [28]、Au NR@Ag NPs [29]和Au NC@Ag NPs [30]。

在这里，我们提出了一种集成了适配体功能化的金纳米星@Ag纳米粒子和磁性氧化石墨烯（MGO）的协同SERS平台，用于超灵敏地同时检测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌（图1）。这一独特设计利用了三个关键优势：（1）通过Au NSs@Ag NPs核壳结构的尖端增强等离子体效应实现最大信号增强，结合预嵌入的拉曼报告剂（ATP/NTP）提供稳定的信号输出；（2）MGO平台实现了高效的样本处理，能够快速从复杂的大体积样本中磁分离和纯化目标细菌；（3）双重适配体识别系统提供了卓越的特异性和可靠的组装过程，严格控制了由随机纳米粒子聚集引起的信号变化。这种集成方法克服了传统SERS检测平台在灵敏度、效率和特异性方面的关键限制。

材料

硝酸银（AgNO3）、氯金酸（HAuCl4）、柠檬酸钠、抗坏血酸钠、聚（乙烯基吡咯烷酮）（PVP）、4-氨基硫酚（ATP）和4-硝基硫酚（NTP）、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐（sulfo-NHS）均购自Sigma-Aldrich（中国上海）。氧化石墨烯（GO）购自南京XFNANO材料科技有限公司。硫酸铁(III)十二水合物（NH4Fe(SO4)2·12H2O）和铁(II)

MGO的表征

图2A中的TEM图像显示了具有部分褶皱和皱缩的多层GO纳米片。图2B-C表明，磁性Fe3O4纳米粒子已成功生长并锚定在这些皱缩的GO纳米片上。Fe3O4纳米粒子的直径在10到20 nm之间，未观察到明显的聚集现象。Fe3O4纳米粒子的均匀分布预期会增强MGO的水分散性和磁分离能力。如图2F所示，合成的MGO表现出

结论

总结来说，我们成功开发了一种基于Au NSs@Ag NPs/MGO组装体的多重适配体传感器，用于灵敏且同时检测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。该传感平台采用了一种协同设计的系统，其中预负载有拉曼报告剂（ATP/NTP）的Au NSs@Ag NPs与MGO共同与双重适配体系统结合。该设计利用特定的适配体-目标识别来指导SERS活性复合物的可编程组装，确保了高灵敏度和稳定性。

CRediT作者贡献声明

冯蓉：撰写–审稿与编辑，撰写–初稿，方法学研究，数据分析，数据管理。郭星蕾：撰写–审稿与编辑，撰写–初稿，验证，数据分析，形式分析，数据管理。张建豪：项目监督，项目管理，概念构思。严文静：方法学研究，数据获取，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了重庆市教育委员会科技计划[项目编号：KJQN202403903]和四川美食发展研究中心[项目编号：CC24Z16]的研究项目支持。