通过连续细胞传代降低一种现代中国PRRSV-1毒株的毒力，并评估其作为改良活病毒疫苗候选物的保护效果

《Virology》：Attenuation of a contemporary Chinese PRRSV-1 strain via serial cell passage and evaluation of its protective efficacy as a modified live virus vaccine candidate

PRRSV-1减毒疫苗研发及效果评估。通过对中国流行株GXFS20220129进行100代细胞传代，获得减毒株P100。基因组分析显示其含37个核苷酸突变和19个氨基酸替换，集中于nsp1-3和GP2区域。体内试验证实P100疫苗能完全保护猪只免于PRRSV-1 challenge，显著降低肺和肠道组织病毒载量，减少病变，并诱导高效抗体应答。该研究为我国自主研发PRRSV-1活疫苗提供了重要实验依据。

　　

Jianming Long|Keyi Liu|Yiting Chen|Xindong Wang|Zhiying Su|Guoyang Li|Kang Zhang|Tongwei Ren|Yifeng Qin|Kang Ouyang|Ying Chen|Weijian Huang|Yeshi Yin|Yingyi Wei|Zuzhang Wei

中国广西大学动物科学与技术学院动物传染病与分子免疫学实验室，南宁，530005

摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒1型（PRRSV-1）对全球养猪业造成了巨大的经济负担。在中国，只有1型亚型在23个省份中流行，不断进化的病毒亚群给现有的防控措施带来了挑战。由于中国尚未有许可的PRRSV-1疫苗，因此开发针对流行亚型的定制疫苗变得尤为紧迫。本研究通过100次连续传代（P100）在MARC-145细胞上弱化了当前中国流行的PRRSV-1分离株（GXFS20220129），并评估了其作为减毒活疫苗（MLV）候选物的有效性。体外实验显示，P100的病毒生长动力学增强，形成的病毒斑块形态也有所改善。全基因组测序发现P100中有37个核苷酸突变和19个氨基酸替换，这些变化主要集中在nsp1-3和GP2区域，可能与病毒弱化有关。在仔猪体内评估了其免疫原性和保护作用。接种P100疫苗的组在感染后没有出现临床症状，体重增长与空白对照组相当，并且在感染后14天内表现出强烈的血清转化。曲线下面积（AUC）分析（28–42天）显示，接种疫苗的猪鼻部分泌的病毒量显著降低，抗体反应更强；而感染组之间的累积病毒血症和直肠分泌物AUC没有显著差异。接种疫苗后，病毒血症得到缓解，病毒清除速度加快，系统组织（心脏、肝脏、肺、肾脏）和肠道段（十二指肠、回肠、直肠）中的病毒载量显著降低，病毒排出动力学也发生了变化。免疫动物的肺部和肠道的肉眼和组织病理损伤明显减轻。总体而言，连续传代产生了具有全面保护作用的弱化PRRSV-1株，表明其有望成为中国控制PRRSV-1的减毒活疫苗候选物。

引言

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的，这是一种高度传染性的病毒性疾病，对全球养猪业造成了巨大的经济损失（Nathues等人，2017年）。PRRSV属于Arteriviridae科的Betaarterivirus属，分为两个主要物种：PRRSV-1（Betaarterivirus suid-1，原型Lelystad病毒）和PRRSV-2（Betaarterivirus suid-2，原型VR-2332）（Brinton等人，2021年）。其约15 kb的正链RNA基因组至少包含11个开放阅读框（ORFs）。ORF1a和ORF1b编码的多聚蛋白会被切割成非结构蛋白（nsps），而ORF 2–7编码结构蛋白，包括GP2、E、GP3、GP4、GP5、ORF5a、M和N（Snijder等人，2013年；Li等人，2019年）。 PRRSV-1具有显著的遗传多样性，至少可分为四个亚型（Yim-Im等人，2025年）。不同亚型之间的致病性存在差异，其中2型和3型亚型通常具有高度致病性，而1型亚型历史上被认为具有中等或低致病性（Stadejek等人，2017年；Frydas等人，2015年；Yuzhakov等人，2017年）。然而，这一观点正受到新型高致病性1型亚型的出现挑战。例如，意大利株PR40/2014表现出高致病性（Canelli等人，2017年）。最近，Rosalia谱系的高致病性PRRSV-1株在西班牙引发了严重的疾病暴发，凸显了PRRSV-1向更高致病性进化的趋势及其对养猪健康的重大威胁（Martín-Valls等人，2023年；Curto等人，2025年）。 在中国，PRRSV-1已传播到至少23个省份，目前发现的所有流行株都属于1型亚型（Sun等人，2023年；Qiu等人，2025年）。通过自然选择，形成了四个主要亚群：BJEU06-1样、HKEU16样、Amervac样和NMEU09-1样（Qiu等人，2025年）。关键的是，该病毒仍在进化，新的独立亚群不断出现，增加了遗传多样性，进一步加剧了疾病防控的难度（Wang等人，2016年，2023年；Li等人，2023年；Xu等人，2023年，2024年）。中国缺乏许可的PRRSV-1疫苗，这凸显了该国养猪疾病防控策略中的重大缺口。 减毒活疫苗（MLV）是控制PRRSV的关键，因为它们能够诱导持久的免疫力且相对于灭活疫苗更具成本效益（Li等人，2019年；Leng等人，2012年；Zhang等人，2011年；Huang等人，2019年）。目前中国的防控措施主要依赖于生物安全和管理措施，但PRRSV-1的流行仍在持续增加，迫切需要有效的定制疫苗（Sun等人，2023年；Qiu等人，2025年）。全球范围内新出现的高致病性PRRSV-1株进一步凸显了主动开发疫苗的必要性。虽然国际上已有Ingelvac PRRSFLEX? EU和Porcilis? PRRS等商业MLV疫苗，但它们对中国特有的、不断进化的PRRSV-1亚型的有效性尚不明确，且在中国尚未获得批准使用（Duerlinger等人，2022年；Stadler等人，2016年，2018年；Madapong等人，2020年；Do等人，2020年；Cao等人，2018年；Scortti等人，2006年）。因此，基于当前中国PRRSV-1株开发MLV候选物是一项紧迫的任务。 为了满足这一需求，我们通过连续传代在MARC-145细胞上弱化了最近发现的中国PRRSV-1分离株GXFS20220129——该株具有独特的肠道趋向性和严重的临床表现（Liu等人，2025年）。本研究旨在评估所得弱化株GXFS20220129-P100的体外特性和体内保护效果，从而为控制中国的PRRSV-1提供候选疫苗和基础。

细胞与病毒

选择具有流行病学意义的强毒PRRSV-1分离株GXFS20220129（GenBank: OR333953.1）进行弱化和疫苗开发，因为它是中国近期疫情的主要致病株（1型亚型）。其流行病学重要性和高度致病性（表现为独特的肠道趋向性和仔猪高死亡率）使其成为疫苗诱导免疫的理想靶标（Liu等人，2025年）。使用的MARC-145细胞...

连续传代增强了MARC-145细胞中的病毒生长动力学和病毒斑块形态

PRRSV-1分离株GXFS20220129在MARC-145细胞上连续传代至第100代（P100）。使用不同传代次数的病毒株（P3、P20、P40、P60和P100）来测定其在MARC-145细胞上的生长曲线。结果显示，随着传代次数的增加，病毒滴度显著上升。如图1所示，P100在细胞适应性方面表现良好。与P3株相比，P100株更快、更明显地引发了细胞病变...

讨论

PRRSV是一种高度传染性的RNA病毒，对全球养猪业构成重大威胁。PRRSV-1已在中国至少23个省份流行（Sun等人，2023年）。最近的流行病学研究表明，中国PRRSV-1株的流行率持续上升，新出现的株具有中等致病性（Qiu等人，2025年）。PRRSV基因组高度变异，频繁发生突变和重组事件，进一步增加了其遗传多样性...

CRediT作者贡献声明

Jianming Long：撰写初稿、正式分析、概念构思。 Keyi Liu：验证、方法学、正式分析、数据管理。 Yiting Chen：验证、研究、数据管理。 Xindong Wang：可视化、验证、方法学。 Zhiying Su：验证、研究、数据管理。 Guoyang Li：验证、正式分析。 Kang Zhang：软件支持、资源提供。 Tongwei Ren：验证、软件支持。 Yifeng Qin：监督、研究指导。 Kang Ouyang：监督、项目管理。

伦理审批

动物实验获得了广西大学动物实验委员会的批准，批准号为（GXU2022-266）。

资助

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：32172889和32370345）和广西自然科学基金（项目编号：2024JJA130133和2018GXNSFDA281021）的资助。

利益冲突声明

所有作者声明没有可能影响本研究的财务、职业或个人利益冲突。