牛副结核亚临床感染中miRNA介导的回肠与回肠淋巴结免疫调控机制

《Scientific Reports》：MicroRNA-mediated regulatory mechanisms in cow’s ileum and ileum lymph node in response to Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis infection

本研究针对牛副结核病（Johne's disease, JD）早期诊断难、分子机制不清的难题，通过比较健康牛（HC）、副结核阳性牛（JDP）及耐受性牛（MAPT）的回肠（IL）、回肠淋巴结（ILLN）和肝脏的miRNA转录组，揭示了组织特异性miRNA调控网络。研究发现bta-miR-146a、bta-miR-146b等关键miRNA通过调控细胞因子受体活性、T细胞受体信号通路等免疫相关功能，驱动宿主对MAP感染的差异应答，为开发早期生物标志物提供了新靶点。

　　

在奶牛养殖业中，副结核病（Johne's disease, JD）是一种由禽分枝杆菌副结核亚种（Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis, MAP）引起的慢性肠炎，不仅导致产奶量下降、繁殖障碍和体重减轻，还因病原体通过粪便排菌造成环境污染和群体传播，给产业带来巨大经济损失。更值得注意的是，MAP感染与人类克罗恩病（Crohn's disease）的潜在关联，使得对其发病机制的研究显得尤为紧迫。然而，当前用于检测亚临床感染的方法（如ELISA和粪便PCR）灵敏度低，难以在感染早期实现准确识别，加之缺乏有效治疗手段，因此深入揭示MAP感染的分子调控机制，寻找可靠的生物标志物，成为防控该病的关键。

以往的研究多聚焦于基因组变异或转录组变化与MAP感染易感性的关联，但对microRNA（miRNA）这一重要的转录后调控因子在JD中的作用了解甚少。miRNA是一类长度约22个核苷酸的非编码RNA，通过降解靶mRNA或抑制其翻译，广泛参与免疫调节、细胞分化和代谢等生命过程。在牛体内，miRNA的表达变化已被发现与多种细菌感染相关，但它们在MAP感染肠道组织及引流淋巴结中的特异性调控网络仍不明确。特别是对于表现出不同感染表型的牛只——即临床感染的JD阳性（JDP）牛和能耐受感染而不发病的MAP耐受（MAPT）牛——其miRNA表达谱有何差异，这些差异又如何影响宿主的免疫应答和疾病进展，是本研究旨在解决的核心问题。

为此，研究团队在《Scientific Reports》上发表了最新成果，通过对健康对照（HC）、JDP和MAPT牛的回肠（IL）、回肠淋巴结（ILLN）及肝脏组织进行小RNA测序（miRNA-Seq），系统绘制了miRNA表达图谱，并通过差异表达分析、靶基因预测和功能富集分析，揭示了miRNA在MAP感染中的组织特异性和表型驱动作用。

关键技术方法

研究选取加拿大魁北克和安大略省商业牧场中经血清ELISA和粪便PCR确诊的4头JDP牛、5头MAPT牛和5头HC牛，采集其IL、ILLN和肝脏组织。利用miRNeasy试剂盒提取总RNA，经质量检测（RIN≥7.0）后构建miRNA-Seq文库，在Illumina HiSeq 2500平台进行单端50 bp测序。原始数据经nf-core/smrnaseq流程处理，包括质量控控（FastQC）、接头去除（Trim Galore!）和比对（Bowtie）至牛参考基因组（ARS-UCD1.2）和miRBase数据库（v22.1）。差异表达miRNA（DE miRNA）通过DESeq2软件（|log₂FC|>1且p<0.05）鉴定，并利用TargetScan预测靶基因，结合Spearman相关性分析（|rho|>0.3且FDR<0.05）筛选高置信靶标。功能富集分析采用ClueGO进行GO和KEGG通路注释（FDR<0.05为显著），并通过qPCR（以UniSp6为内参）验证部分miRNA表达。

研究结果

1. 组织特异性miRNA表达谱

研究在IL、ILLN和肝脏中分别鉴定到441、405和201个miRNA，包括12个共同高表达miRNA（如bta-miR-143、bta-miR-145）。其中，bta-miR-143在IL中表达最高（平均读长计数约154万），显著高于ILLN和肝脏，提示其在肠道功能中的核心地位。ILLN中DE miRNA数量最多（JDP vs. HC组20个，MAPT vs. HC组21个），而肝脏仅3个DE miRNA，凸显免疫相关组织的应答活跃性。

2. 表型驱动性DE miRNA鉴定

在IL中，JDP vs. HC比较发现17个DE miRNA（4个上调、13个下调），MAPT vs. HC组有8个DE miRNA，JDP vs. MAPT组有6个。关键miRNA如bta-miR-146a、bta-miR-146b和bta-miR-147在JDP和MAPT组中均上调，但JDP组表达更高；而bta-miR-125a和bta-miR-100等则显著下调。ILLN中，bta-miR-2305在三个比较中均差异表达，且在JDP组表达最高，可能作为感染严重度的指示因子。

3. 跨组织共享的免疫相关miRNA

11个DE miRNA在IL和ILLN中共同出现，如bta-miR-146b（JDP vs. HC组在IL和ILLN均上调）、bta-miR-375（在IL下调而在ILLN上调），表明其跨组织协调免疫应答的潜力。这些miRNA的靶基因显著富集于细胞因子受体活性、白细胞迁移等免疫过程。

4. 功能富集揭示免疫与代谢调控网络

IL中DE miRNA的靶基因显著富集于68个GO术语和7条KEGG通路，包括细胞因子受体活性（GO:0004896）和溶酶体通路（KEGG:04142）。ILLN中则富集于27个GO术语和20条通路，如Ras信号通路（KEGG:04014）和趋化因子信号通路（KEGG:04062）。值得注意的是，JDP和MAPT表型由截然不同的miRNA集合驱动，例如MAPT组特有富集于FoxO和Notch信号通路，提示耐受表型可能涉及细胞存活与代谢重编程。

5. qPCR验证数据可靠性

对ILLN中bta-miR-146a、bta-miR-146b、bta-miR-147和bta-miR-221的qPCR验证结果与RNA-seq高度一致，证实了测序数据的准确性。

结论与意义

本研究首次系统描绘了牛副结核病中回肠、回肠淋巴结和肝脏的miRNA调控图谱，揭示miRNA通过组织特异性方式协调免疫应答。其中，bta-miR-146a/b、bta-miR-147等关键miRNA的持续上调，可能通过抑制炎症因子产生和调节细胞凋亡，助长MAP的免疫逃逸；而bta-miR-100等下调则可能解除对脂质代谢基因的刹车，导致巨噬细胞脂质蓄积——这正是MAP持久感染的特征。此外，JDP与MAPT表型背后迥异的miRNA驱动集合（如MAPT组富集Notch通路），为理解“感染耐受”提供了新视角：某些牛或能通过miRNA重编程，将病原体限制在可控状态而非引发过度炎症。

这些发现不仅丰富了牛miRNA数据库，更为开发早期诊断生物标志物（如血液中的bta-miR-100）和靶向治疗策略（如调控miR-146a缓解炎症）奠定了理论基础。未来功能实验验证特定miRNA的靶基因网络，将有望推动JD防控从被动检测转向主动干预，最终减轻养殖业负担并保障公共卫生安全。