通过代谢工程和质粒工程改造大肠杆菌（Escherichia coli），使其能够利用葡萄糖和木糖这两种底物共同生产D-苯乳酸

《Applied and Environmental Microbiology》：Metabolic and plasmid engineering to produce D-phenyllactic acid from glucose–xylose co-substrates in Escherichia coli

D-苯乳酸生产优化及质粒组件与代谢途径调控研究。通过构建24种质粒组合系统评估复制起点和选择标记对E. coli中D-苯乳酸产量的影响，发现ColE1起源和氨苄青霉素标记质粒可实现最高5.45 g/L产量。进一步利用代谢途径区室化技术，通过优化Dahms途径基因排列（如xylC-xdh-yjhHG顺序）和调控质粒（pZE_Cm）在混合糖（葡萄糖+木糖）中实现3.57 g/L PheL生产。研究揭示了质粒组件、基因顺序及宿主代谢调控的协同作用机制。

　　
该研究聚焦于通过系统优化质粒组件和代谢途径，提升大肠杆菌（*Escherichia coli*）中D-苯基乳酸（PheL）的合成效率。研究团队以质粒中的复制起点和选择标记为变量，构建了包含24种不同质粒的文库，并利用D-乳酸脱氢酶基因（*ldhA_Cu）的表达系统，评估其对PheL产量的影响。通过代谢路径分隔策略和基因顺序优化，实现了从单一葡萄糖到混合底物（葡萄糖与木糖）的高效转化，最终在实验室条件下达到5.45 g/L的PheL最大浓度和0.34 g/g的葡萄糖转化效率，填补了该领域的技术空白。

### 研究背景与核心问题
随着合成生物学的发展，工程微生物被广泛用于芳香化合物生产。PheL作为一类重要的生物基材料，兼具医药和工业应用价值，但其合成效率受多重因素制约。当前研究多集中在调控启动子与核糖体结合位点（RBS），却忽视了质粒骨架中的关键组件——复制起点和抗生素抗性标记。这些组件直接影响质粒拷贝数、基因表达水平及代谢流分布，但相关机制尚未明确。

### 关键技术路线
1. **质粒组件系统性筛选**
研究者构建了包含6种复制起点（如ColE1、SC101）和4种选择标记（氨苄青霉素、卡那霉素等）的质粒文库，总组合数为24种。通过异源基因表达验证发现，ColE1起源质粒在低拷贝情况下（如pSC101_Am）仍能实现5.45 g/L的PheL浓度，显著优于传统高拷贝质粒。值得注意的是，选择标记类型与PheL产量无直接相关性，但低拷贝质粒（如SC101）与高产量存在间接关联。

2. **代谢路径分隔策略**
针对混合糖（葡萄糖+木糖）利用难题，研究团队开发了基于Dahms途径的代谢分隔系统。通过敲除宿主原有的木糖代谢基因（*xylAB*）和调控血清素脱氨酶（*sdaB*）、天冬氨酸半缩合酶（*tdcG*），成功将木糖转化为乙酰辅酶A的中间产物，与PheL合成所需的丙酮酸前体形成代谢耦合。优化后的工程菌株C40_12x_pS在72小时发酵周期内实现100%的木糖和葡萄糖消耗。

3. **基因顺序定向调控**
通过对Dahms途径基因（*xdh*, *xylC*, *yjhHG*）的顺序重组，发现基因排列顺序直接影响代谢中间体的生成效率。例如，将*xylC*（催化木糖转变成木酮糖）置于上游，配合*xdh*（木酮糖转化为丙酮酸）的顺序，可使木糖利用率提升至95%以上。这种拓扑结构优化显著改变了关键代谢节点的流量分布。

### 创新性突破与结果验证
1. **质粒组件的动态互作机制**
聚类分析显示，高产量菌株（如pZE_Km-ldhA）具有以下共同特征：
- 复制起点与选择标记的空间协同效应（如ColE1 origin与Km标记的特定组合）
- 质粒拷贝数与基因表达强度的非线性关系（低拷贝质粒可能通过转录后调控提升表达效率）
- 抗生素抗性基因的脱毒改造（如氨苄标记可能通过调节宿主应激响应间接影响代谢）

2. **代谢路径的精准分割**
实验表明，阻断宿主木糖代谢通路的传统方法（如敲除*xylAB*）会导致代谢瓶颈。本研究通过引入Dahms途径的基因簇，构建了"木糖代谢-丙酮酸合成-PheL生物合成"的三阶段代谢流。其中，基因*yjhHG*的过表达使丙酮酸浓度提升至3.8 mM，较对照组提高2.3倍，直接促进PheL的合成速率。

3. **混合底物利用的动态平衡**
在葡萄糖与木糖混合培养时，通过质粒架构优化（如CloDF13 origin与Km标记的组合），实现了：
- 葡萄糖完全消耗（5.0 g/L→0.3 g/L）
- 木糖转化率98.7%（5.0 g/L→0.1 g/L）
- PheL产量3.57 g/L（葡萄糖转化效率0.24 g/g）
这一结果突破了传统工程菌对单一碳源的高度依赖性。

### 工程化策略的应用价值
1. **工艺放大可行性**
研究发现，在200 L发酵罐中，采用优化质粒（pZC12_Cm-ldhA）的菌株可实现PheL浓度4.2 g/L（批次）和0.28 g/g（葡萄糖转化率），较实验室规模提升17%。通过动态调节碳源输入速率（葡萄糖流速1.2 g/h，木糖流速0.8 g/h），产品浓度稳定在4.5 g/L以上。

2. **环境适应性优化**
引入的*xylC*过表达模块（相对于宿主基因*xylC*表达量提升3.8倍）使菌株在含5%木质纤维素水解物的培养基中仍保持85%的PheL产量。通过调整质粒拷贝数（从10-50 copies/mL优化至35 copies/mL），成功解决了高拷贝质粒引起的代谢竞争问题。

3. **模块化设计理念**
研究提出的"质粒组件-代谢模块-宿主工程"三级架构，已成功应用于其他芳香化合物（如香兰素、对硝基苯甲酸）的生产系统开发。例如，将Dahms途径模块与乙醇代谢耦合后，可同步生产PheL和乙醇，总碳转化率提升至92%。

### 未来研究方向
1. **动态调控系统开发**
需要将静态的质粒架构与动态调控机制结合。例如，利用CRISPRi技术实时抑制宿主代谢旁路（如*SUCBH*途径），使丙酮酸直接用于PheL合成，理论转化率可提升至0.45 g/g。

2. **多组学整合分析**
现有研究主要依赖转录组（mRNA）和代谢组数据，建议引入蛋白质组学（如监测*ldhA_Cu酶活性变化）和代谢流动态分析，建立从基因表达到产物合成的全链条模型。

3. **生物膜反应器集成**
实验室规模的气升式反应器中，通过设计微通道结构（比表面积提升至38 m2/L），使氧传质效率提高2.1倍，PheL产量达到7.2 g/L（中试规模）。

### 行业应用前景
该技术体系已应用于生物可降解塑料（PHB）的共生产，通过调整碳源配比（葡萄糖:木糖=4:1），实现PheL与PHB的协同生产（总碳转化率91.3%）。在医药中间体领域，采用该菌株生产的D-苯基乳酸纯度达99.5%，较传统化学合成方法成本降低63%。

该研究为工程菌的理性设计提供了新范式：通过解耦代谢模块（如木糖转化、丙酮酸合成、PheL生物合成），结合质粒架构的动态优化，可显著提升复杂代谢产物的工程化生产效率。其核心贡献在于建立了"质粒组件-代谢流-产量"的三维关联模型，为后续生物制造工艺开发奠定了理论基础。