《Biochemical Engineering Journal》：An Adsorption-Crosslinking Immobilization Approach for Enhancing the Operational Stability of D-Allulose 3-Epimerase Immobilized on Chitosan-Modified Resin
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D-allulose 3-epimerase（DAE）固定化策略通过壳聚糖修饰树脂结合戊二醛交联，显著提升酶热稳定性、pH稳定性和循环稳定性，连续运行29天保持高效活性，载体可高效再生，为绿色生物催化生产D-allulose提供实用方案。
郑英英|刘宏伟|郭淑敏|费静文|王俊清|王瑞明|李丕武
中国山东省济南市齐鲁工业大学绿色造纸与资源回收国家重点实验室
摘要
D-阿洛酮糖是一种天然存在的稀有酮己糖，可作为蔗糖的替代品。在本研究中，我们开发了一种基于壳聚糖（CTS）改性树脂的新型吸附-交联固定化策略。经过筛选15种树脂类型后，选择了D213和ZGA351作为载体，并用戊二醛对CTS改性的载体进行交联，以固定D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DAE；EC 5.1.3.30）。CTS改性显著提高了固定化酶的性能，D213@CTS@DAE和ZGA351@CTS@DAE的活性恢复率均高于未改性的载体。固定化酶的热稳定性、pH稳定性和储存稳定性也明显高于游离酶。D213@CTS@DAE在多次回收和再利用循环后仍保持较高的初始活性，并在连续运行29天后在填充床反应器中持续表现出生产力。载体材料可以高效再生和重复使用。再生后，固定化酶在五个循环后仍保持较高的活性保留率。这些发现为D-阿洛酮糖的生产提供了一种绿色生物催化解决方案，增强了固定化酶的实际应用性和商业可行性。
引言
D-阿洛酮糖，也称为D-吡科糖，是一种天然存在的稀有酮己糖，是D-果糖的C-3差向异构体。它的甜度约为蔗糖的70%，但热量仅为0.4千卡/克，使其成为蔗糖的理想替代品[1]、[2]。此外，D-阿洛酮糖还具有显著的降血糖、抗肥胖和神经保护作用[3]、[4]。基于这些特性，D-阿洛酮糖在健康食品和膳食补充剂行业中具有很高的应用潜力[5]。
D-阿洛酮糖的生产主要依赖于酶法转化或化学合成[6]。在酶法转化中，使用特定酶（如D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DAE；EC 5.1.3.30）将D-果糖转化为D-阿洛酮糖，由于其高产率、高效性和环保性等优点而被广泛采用。然而，游离酶在实际应用中存在一些瓶颈，例如成本高、稳定性差以及回收和再利用困难[7]。酶的固定化是一种有效策略，可以克服这些限制[8]。在功能性糖的合成过程中，固定化技术有助于降低酶的生产和纯化成本，使过程更加高效和环保[9]。已经探索了多种固定化技术来克服游离DAE的局限性。DAE已成功固定在各种载体材料上，如磁性金属-有机框架（MOFs）、生物硅基有机-无机复合载体[10]、超顺磁性钴铁氧体纳米粒子载体[11]和定制的双金属杂化纳米花[12]。尽管取得了进展，但固定化酶系统在关键性能指标（如操作半衰期、可回收性、操作便捷性和成本效益）方面仍需进一步改进，以满足工业应用的需求。
树脂已被广泛用作酶的固定化载体，包括用于DAE[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。例如，Yoshihara等人[18]证明，从Arthrobacter globiformis M30中提取的DAE在离子交换树脂上固定后，在柱式反应器中可稳定超过四个月。此外，Ding等人[19]证明，将预合成的含DAE的杂化纳米花与LXTE-606大孔树脂共固定后，复合生物催化剂在八次操作循环后仍能保持超过60%的初始活性。这些研究表明，树脂是一种多功能的DAE固定化平台，通过针对性的表面改性进一步增强了其功能。壳聚糖是一种由壳聚糖脱乙酰化得到的线性多糖，主要由β-(1→4)-D-葡糖胺单元组成[20]。其高生物相容性、可生物降解性、无毒性和丰富的化学改性性使其成为非常有前景的天然聚合物固定化载体材料[21]。Benucci等人[22]使用溶剂浇铸技术制备了壳聚糖/纳米粘土复合载体。壳聚糖的物理复合作用提高了稳定性、表面积和孔隙率。Atiro?lu等人通过使用交联剂将过氧化氢酶与壳聚糖共价交联，显著提高了过氧化氢酶的稳定性和回收效率[23]。El-Shora等人制备了用于去除酚类和脱色染料的壳聚糖微球[24]。
我们利用了树脂的良好结构特性和工业实用性，以及壳聚糖的成本效益、优异的生物相容性和功能化潜力，通过使用壳聚糖改性树脂表面来构建复合载体（CTS@树脂）。这种策略可以通过戊二醛交联实现DAE的有效和稳定固定。树脂的多孔结构促进了高效的质量传递，而CTS衍生的活性氨基增强了酶与载体的结合，并创造了有利于维持酶活性构象的亲水微环境。与戊二醛的共价交联进一步固定了酶，从而减少了酶的泄漏。这种策略产生了具有高催化活性、操作稳定性和成本效益的固定化DAE，促进了D-阿洛酮糖的高效和绿色生产。
化学试剂
DAE（10000 U·g?1，EC 5.1.3.30）购自中国江苏省中诺生物科技有限公司。树脂（D213、ZGA351、ZGA313、ZGD630、ZGA304、ZGA302、D301、EP107F、EP109F、EP104F、EP104M和EB105C）购自中国浙江省宁波正光树脂有限公司。树脂D319购自中国江苏省苏清水处理工程集团有限公司，树脂IR120购自美国宾夕法尼亚州的罗姆和哈斯公司。
树脂筛选
使用不同树脂制备的固定化酶在酶活性上存在显著差异，这主要归因于载体孔径、比表面积和表面极性的变化[28]。15种不同树脂的性质，包括树脂类型、强基团容量和粒径的差异，列在补充表S1中。这里选择了15种树脂作为DAE固定的初始筛选载体。
结论
本研究通过壳聚糖改性树脂的协同吸附和戊二醛的共价交联，建立了一种有效的酶固定化策略。这种方法显著提高了D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DAE）的操作稳定性，满足了工业应用的关键要求。系统筛选确定了D213和ZGA351是15种商业树脂中的最佳载体。壳聚糖的表面改性引入了丰富的氨基。
资助
本工作得到了“生物催化酶和特种工业酶关键技术及应用示范”（2024ZDZX03）、“基于绿色造纸工艺的高价值利用所有组分关键技术研究开发”（2025ZDGZ02）以及“海友产业专家计划”（CYLJ20231811336）的支持。
CRediT作者贡献声明
李丕武：监督、资源管理、资金筹集。
王瑞明：监督、资源管理、资金筹集。
王俊清：监督、资源管理、资金筹集。
费静文：撰写 – 审稿与编辑。
郭淑敏：撰写 – 审稿与编辑、实验研究。
刘宏伟：撰写 – 审稿与编辑、数据分析、数据管理。
郑英英：撰写 – 原始草稿、方法设计、实验研究、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢齐鲁工业大学生物基材料与绿色造纸国家重点实验室提供的帮助。
