地西泮对从鲶鱼（Silurus asotus）头部肾脏中分离出的巨噬细胞具有免疫抑制作用

《Fish & Shellfish Immunology》：Diazepam exerts immunosuppressive effects on macrophages isolated from the head kidney of catfish ( Silurus asotus)

本研究调查了地西泮（DZ）对 Amur 鲶鱼头肾巨噬细胞的影响，发现其剂量依赖性诱导细胞聚集和吞噬活性降低，并通过转录组分析揭示免疫相关通路抑制，提示神经活性药物对水生生态系统的潜在免疫抑制风险。

　　

韩思俊（Sijun Han）| 成敏佳（Minjae Seong）| 金光赫（Gwanghyeok Kim）| 郑大允（Dahyun Jeong）| 林赛妍（Saeyeon Lim）| 朴英真（Youngjin Park）

韩国安东市顺 Moon 大学水生生物医学科学系，邮编 31460

摘要

地西泮（Diazepam，简称 DZ）是一种常见的苯二氮卓类药物，越来越多地在水生环境中被检测到，但其在鱼类体内的免疫学效应仍知之甚少。我们研究了浓度在 1 至 10 mg/L 之间的 DZ 对阿穆尔鲶鱼（Silurus asotus）头肾来源的巨噬细胞的影响。细胞活力未受影响，但 DZ 诱导了巨噬细胞的聚集，并显著降低了其吞噬活性。转录组分析显示有 1,053 个基因的表达发生了变化，其中包括 PI3K-Akt、MAPK、吞噬体信号通路和 Toll 样受体信号通路等免疫相关通路的抑制。神经炎症负调节因子转运蛋白的表达增加进一步支持了上述通路的抑制作用。这些发现表明 DZ 会减弱巨噬细胞的免疫功能，凸显了神经活性药物在水生系统中的免疫抑制风险。我们的研究为 DZ 暴露引发的神经-免疫相互作用提供了机制上的见解，强调了将精神药物视为新兴生态污染物的必要性。

引言

通常，人们服用药物是为了预防和治疗人类和动物的各种疾病。然而，这些药物的广泛使用也带来了一个意外的后果：通过家庭不当处理、医疗过度处方以及医疗设施和制药行业的废水等多种途径，水生环境可能会受到药物的污染[1]。最近，在新冠病毒（COVID-19）大流行期间，抗生素和抗焦虑药的过度使用显著增加了药物向水生环境的释放[2],[3]。实际上，在北美[4]、西班牙[5]、韩国[6],[7]以及非洲[9]等国家的城市地表水中，可以检测到多种抗焦虑药、止痛药和麻醉剂的残留。其中，神经活性物质尤其令人担忧，因为它们倾向于在神经组织中积累，并可能破坏重要的神经生理功能[10],[11],[12]。此外，这些物质及其代谢产物在各种水生生物体内的积累可能会通过干扰关键的生理和免疫过程带来风险[13],[14],[15],[16],[17]。

地西泮（DZ）是一种神经活性物质，是最广泛用于治疗焦虑及相关疾病的苯二氮卓类药物。它作为一种 GABA-A 受体的正变构调节剂（PAM），不会直接激活受体，而是在 GABA 存在的情况下增强 γ-氨基丁酸（GABA）的作用，从而增加 GABA 诱导的通道开放频率、程度和持续时间。这导致氯离子流入增加，神经元膜过度极化，进而抑制神经元兴奋性[18],[19]。DZ 的药理作用在脊椎动物中已被充分研究，尤其是在哺乳动物中。对于硬骨鱼类，研究发现了苯二氮卓类药物与 GABA-A 受体的相似结合特性，尽管鱼类和哺乳动物之间存在一些功能差异[20]。然而，由于滥用和过量使用，DZ 会导致成瘾，因此在使用时需要格外小心[21],[22],[23]。这种广泛且往往不当的使用增加了 DZ 残留物释放到自然水系统中的可能性，从而引发了对其环境暴露和潜在生态风险的担忧[24]。这表明 DZ 可能会对鱼类的神经生物学和行为产生影响[25]。

巨噬细胞在鱼类的先天免疫系统中起着重要作用，通过吞噬作用抵御环境中的病原体。此外，它们对于启动和调节适应性免疫反应至关重要[26],[27],[28],[29]。已有研究表明，DZ 对哺乳动物的巨噬细胞具有免疫抑制作用，尤其是通过影响巨噬细胞的活性和炎症细胞因子的调节[30],[31],[32],[33]。在硬骨鱼类中，多项研究探讨了 DZ 对鱼类行为的影响[34],[35],[36]，而对其对硬骨鱼类巨噬细胞的免疫学和毒理学影响的研究仍然有限。

本研究的目的是通过评估巨噬细胞的吞噬活性、细胞聚集和细胞活力来研究 DZ 对阿穆尔鲶鱼（Silurus asotus）的免疫调节作用。此外，还使用了脂多糖（LPS）进行联合处理，以评估 DZ 在 LPS 诱导的炎症条件下的作用。

动物伦理

动物伦理

所有涉及动物护理和标准操作程序均获得了韩国安东市顺 Moon 大学的批准（批准编号：SM-2024-01-01，批准日期：2024 年 3 月 14 日）

试剂和化学品

地西泮（DZ；纯度 ≥ 98%）从韩国食品药品安全厅（Osong）购买。储备溶液用蒸馏水（DW；Duksan Pharmaceutical，Jincheon，韩国）配制。然后将这些溶液与 Leibovitz’s L-15 培养基（L-15；Sigma–Aldrich，Steinheim）混合

从鲶鱼头肾中鉴定巨噬细胞

为了确定巨噬细胞群体，我们采用了流式细胞术的基本分选策略。首先对单细胞群体进行分选以排除细胞聚集（图 1A）。对于巨噬细胞群体的分选，我们使用了前散射链（FSC）与侧散射链（SSC）的图表。FSC 和 SSC 值较低的细胞被鉴定为富含淋巴细胞的群体，而 FSC 和 SSC 值相对较高的细胞被归类为类似巨噬细胞的群体。

讨论

本研究中使用的阿穆尔鲶鱼广泛分布于东亚地区，包括韩国、中国和台湾，是韩国内陆水产养殖场中最常见的淡水养殖物种之一[45],[46],[47]。由于鲶鱼通常生活在低洼地区，它们比远洋鱼类更容易接触到药物，因为释放到自然水系统中的药物往往会在低洼地区积累，从而导致持续的药物暴露

结论

总之，DZ 的暴露并未显著影响巨噬细胞的活力，但引发了明显的功能性和转录变化。这些变化包括巨噬细胞聚集增强、吞噬活性降低，以及 MAPK 信号通路、吞噬体和 TLR 信号通路中多个基因的表达下调。总体而言，这些分子变化表明巨噬细胞处于免疫抑制状态。鉴于鲶鱼在水产养殖中的生态重要性，我们的研究结果具有重要意义

未引用的参考文献

[38]; [62]; [63]; [71]; [76]; [77].

作者贡献声明

韩思俊（Sijun Han）：概念构思、数据整理、可视化、初稿撰写。成敏佳（Minjae Seong）：正式分析、验证。金光赫（Gwanghyeok Kim）：正式分析、数据整理。郑大允（Dahyun Jeong）：实验设计、软件操作。林赛妍（Saeyeon Lim）：实验实施。朴英真（Youngjin Park）：资金获取、项目管理、审稿与编辑。所有作者均已阅读并同意发表的手稿版本。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了顺 Moon 大学 2023 年研究基金的支持。