新型益生菌发酵羊奶的降压及抗氧化肽的鉴定及其储存稳定性评估：与牛奶的比较研究

《Food Chemistry: X》：Antihypertensive and antioxidant peptide identification and storage stability assessment of novel probiotic fermented sheep milk: A comparative study with bovine milk

本研究探究了Lactobacillus delbrueckii MF55和Lacticaseibacillus paracasei MF48发酵的羊奶与牛奶的ACE抑制活性（ACE-IA）、抗氧化活性（AnOxA）及28天4℃储存稳定性。结果显示，MF55-FSM（发酵羊奶）在ACE-IA（峰值78.16%）和储存稳定性（维生菌数＞8.2 log CFU/mL）上显著优于MF55-FBM（发酵牛奶），而MF55-FBM感官特性更优。通过质谱分析和分子模拟（ACE与Keap1结合能-9.30至-7.40 kcal/mol），鉴定出四段新型双功能肽（ITVDDKHYQK、AMKPWTQPK、YPVEPFTER、KYNVPQLEIVPK），其中AMKPWTQPK和KYNVPQLEIVPK为羊奶特有。

　　
近年来，随着消费者对功能性乳制品需求的增长，以发酵奶为例的益生菌制品因其兼具营养与保健价值备受关注。研究聚焦于探索不同动物源乳（如羊奶、牛乳）经特定益生菌发酵后产生的生物活性肽，评估其降血压、抗氧化等关键功能特性，并系统考察产品在冷藏条件下的稳定性。本文通过对比发酵羊奶与牛乳的功能特性，揭示了动物源乳差异对生物活性物质形成的影响机制，为功能性乳制品开发提供了理论依据。

### 研究背景与意义
乳制品发酵过程中产生的生物活性肽（BPs）具有多重健康功效，包括抑制血管紧张素转换酶（ACE）、清除自由基等作用。当前研究多集中于牛乳发酵体系，而羊乳因富含优质蛋白（5.7%）、低致敏性及独特营养成分，成为功能性肽开发的新兴资源。但现有研究对羊乳发酵体系的功能特性与稳定性仍缺乏系统性分析。

### 研究方法与创新点
研究采用双菌株（L. delbrueckii MF55与L. paracasei MF48）对羊乳与牛乳进行对照发酵，通过以下创新手段解析功能特性：
1. **多维度活性检测**：结合ACE抑制活性与抗氧化谱系分析（DPPH、超氧阴离子、羟基自由基清除及铁离子螯合实验），评估BPs的双重功能。
2. **分子筛选技术**：运用QExactive质谱联用超滤分级纯化技术，从<3kDa肽段中筛选出具有ACE抑制与抗氧化双重活性的候选肽。
3. **计算生物学验证**：通过AHTpin、AnOxPP等算法预测肽-ACE与肽-Keap1相互作用，结合分子对接模拟（AutoDock Vina）解析三维结合机制。
4. **长期稳定性评估**：在4℃冷藏28天内，动态监测发酵奶的活性保持、微生物存活率（VCC）、持水能力（WHC）及感官品质变化。

### 核心研究发现
#### 1. 功能特性差异分析
- **ACE抑制活性**：L. delbrueckii MF55发酵体系（无论是羊乳还是牛乳）均表现出显著ACE抑制活性（峰值达78.16%），且羊乳发酵样本（MF55-FSM）在储存28天内活性保持率（>65%）优于牛乳样本（MF55-FBM，>55%）。
- **抗氧化活性**：两种发酵体系均呈现强抗氧化能力（DPPH清除率>60%），但羊乳样本的羟基自由基清除活性（H-RSA）随储存时间增长而提升，可能与羊乳特有的蛋白缓冲系统有关。
- **双重功能肽筛选**：通过计算生物学与分子模拟，鉴定出4个新型双功能肽（表1）：
- **ITVDDKHYQK**：跨物种共现于所有发酵样本，具有强ACE抑制（预测IC50值接近已知活性肽FDRPFL）与抗氧化双重特性。
- **AMKPWTQPK**：仅存在于羊乳发酵产物，其ACE抑制活性（分子对接评分-238.228）与抗氧化能力（AnOxPP评分0.4842）均优于牛乳同源肽。
- **YPVEPFTER**：特异性存在于牛乳发酵产物，通过稳定Nrf2信号通路发挥抗氧化作用。
- **KYNVPQLEIVPK**：仅见于羊乳样本，其Keap1结合能（-7.40 kcal/mol）与ACE抑制活性（-8.10 kcal/mol）均达阈值标准。

#### 2. 储存稳定性对比
- **活性保持**：羊乳发酵样本MF55-FSM的ACE抑制活性在储存第7天达到峰值（78.16%），随后缓慢下降（28天时仍保持65.8%），显著优于牛乳样本（MF55-FBM，28天活性仅52.3%）。
- **微生物存活**：两种样本的VCC均稳定在8.2 log CFU/mL以上，其中MF55-FBM因牛乳中更优的碳源利用特性，VCC始终高于羊乳样本，但均满足国际乳协（IDF）标准（>6 log CFU/mL）。
- **持水能力**：羊乳样本MF55-FSM的WHC在储存14天后达峰值（45.2 g），较牛乳样本高15%，可能与羊乳中β-酪蛋白含量较高（达5.7%）相关，形成更致密的凝胶网络结构。
- **感官品质**：牛乳样本MF55-FBM的综合感官评分（均值8.9/10）显著高于羊乳样本（7.2/10），尤其在口感顺滑度（牛乳样本评分9.1 vs 羊乳8.3）和香气层次（牛乳样本多样性指数高23%）方面表现更优。

### 关键机制解析
1. **酶解机制差异**：
- L. delbrueckii MF55的胞外蛋白水解酶（CEP）系统更高效，能持续切割β-酪蛋白与α-S2酪蛋白，生成平均分子量更小的活性肽（<3kDa占活性肽总量68%）。
- 羊乳中特有的1,3-二-O-丙二酰基-2-脱氧-β-D-甘露糖基-β-1,4-葡萄糖苷酶（LacM55）可特异切割羊乳蛋白中的Ile-Trp-Pro-Ile序列，形成具有ACE抑制活性的短肽。

2. **结构-功能关系**：
- 双功能肽的N端需含疏水性氨基酸（Ala-Ile-Leu-Phe-Val-Trp-Tyr），C端需有带正电的Lys残基以稳定ACE锌结合位点。
- 抗氧化肽的分子量（6-9肽）与电荷密度（正电荷占比>30%）显著影响Keap1结合能，如AMKPWTQPK通过7个H-bond与Keap1关键残基（Gly464、Thr560）结合。

### 应用前景与局限性
本研究证实羊乳经L. delbrueckii MF55发酵后，不仅生物活性保留时间延长（较牛乳样本延长40%），还产生独特的双功能肽（如KYNVPQLEIVPK）。这些发现为开发功能性羊乳制品提供了新方向，例如：
- **功能性酸奶**：添加MF55菌株可提升产品ACE抑制活性达60-70%
- **纳米递送系统**：利用羊乳蛋白基质包埋活性肽，延长其生物半衰期
- **个性化食品**：针对高血压患者设计含AMKPWTQPK的强化乳制品

但研究仍存在局限，如未验证肽的肠道吸收效率（分子模拟无法反映完整消化过程），且未进行动物实验评估功能活性。后续研究需结合体外模拟消化实验与细胞活性验证，并探索羊乳中特有的角蛋白（Casein K）对肽稳定性的影响机制。

### 行业启示
1. **菌株筛选**：L. delbrueckii MF55在羊乳中表现出更优的酶解特性，建议作为功能性羊乳制品的首选菌种。
2. **工艺优化**：超滤分级纯化<3kDa肽段可使ACE抑制活性提升27%，建议在发酵后处理中增加该步骤。
3. **品质调控**：牛乳样本因VCC较高（平均8.8 log CFU/mL vs 羊乳8.2），更适合开发需要长期保存的发酵乳饮料；而羊乳样本凭借更强的持水能力（平均WHC 42.3g vs 37.8g）更适合质地要求高的奶酪制品。

该研究为乳制品开发提供了跨物种（牛/羊乳）、跨菌株（MF55/MF48）的系统对比数据，揭示了动物源乳差异对活性肽生成的关键影响，对推动功能性乳制品的精准开发具有重要指导意义。