《Food Research International》：The fabrication of yolk immunoglobulin and encapsulation by W
1/O/W
2 double emulsion
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本研究通过优化稀释-冷冻-解冻工艺及构建水油水双乳液封装体系，有效提高IgY提取效率与活性，解决传统方法提取时间长、稳定性差的问题，为口服IgY应用提供新策略。
赵正卓|刘静云|朱新宇|李北溪|陈金玉|周琦|王子彦|李艳|陈一杰|郭军
华中农业大学食品科学与技术学院，中国武汉430070
摘要
卵黄免疫球蛋白（IgY）具有较高的免疫反应能力，在感染预防、免疫调节和抗生素替代方面具有潜在应用价值。然而，其口服活性不稳定以及传统提取工艺效率低下限制了其实际应用。为了缩短提取时间并保持较高的活性，我们采用了一种无需稀释的冻融工艺流程，并利用水-油-水（W1/O/W2）乳液将IgY包裹在内部水相中，以保护其免受胃酸的降解。本研究通过多种提取方法对IgY进行了研究，并通过宏观观察、理化检测和活性测定对其进行了评估。结果表明，先稀释后进行冻融处理的流程能够提取出较高量的IgY，并显著提高其活性。为了探讨冷冻时间对提取效果的影响，实验发现仅冷冻1小时即可获得与传统冻融-稀释方法（需冷冻8小时）相当的IgY提取物，且活性更高。此外，我们制备了IgY负载的水-油-水（W1/O/W2）双乳液，对其形态、Zeta电位、储存稳定性和流变特性等理化性质进行了分析，结果表明其包裹效率约为91%。并通过体外模拟消化实验验证了该乳液对IgY的保护和释放功能。
引言
卵黄免疫球蛋白（IgY）是鸟类血清中的主要免疫球蛋白（Warr等人，1995年），它通过血液循环并通过卵黄膜表面的特异性受体转运到卵黄中（Morrison等人，2002年）。离心后，卵黄可分为透明部分和含有黄色不溶性蛋白质颗粒的沉淀物，其中蛋白质颗粒占77%-87%（Chi等人，2024年）。卵黄浆主要由低密度脂蛋白（LDL）组成，占比约85%，以及少量卵黄磷脂（Marc，2013年）。根据结构特征，卵黄磷脂可分为α-、β-和γ-三种形式（Williams，1962年）。IgY属于γ-卵黄磷脂，能与大多数抗原发生免疫反应。在特定抗原的诱导下，可产生具有高免疫检测精度和强免疫反应能力的特异性IgY（Amro等人，2018年；Rose等人，1974年）。水稀释法是最早期的提取方法，具有简单、安全且适合食品应用的优点；但过度稀释会导致大量水分消耗，且对水质要求严格，阻碍了其工业化应用。传统方法中，蛋黄与水按1:9的比例稀释，纯度约为15%-18%（Akita & Nakai，1992年）。其他提取方法常使用聚乙二醇和氯仿等有机试剂（Patel等人，2025年），但这些方法不适用于食品加工。研究表明，IgY在70°C以下具有较好的稳定性，并能耐受冻干和冻融循环（Shimizu等人，1988年）。基于水稀释法，通过冻融过程使LDL发生不可逆凝胶化并离心去除，从而提高IgY的提取纯度（Au等人，2015年；Wakamatsu等人，2018年）。虽然这种方法可将稀释比例降至1:5，但需要在-18°C下冷冻8小时，延长了处理时间（Wang等人，2021年）。因此，需要优化冻融工艺以提高IgY的提取效率并缩短处理时间。
口服IgY被用作食品补充剂，用于对抗胃肠道病原体（Ma等人，2020年；Xing等人，2017年），也可添加到片剂、酸奶、冰淇淋、奶粉等产品中（Horie等人，2004年；Scheraiber等人，2019年）。然而，胃中的强酸环境和胃蛋白酶会显著降低IgY的活性，限制了其口服应用。为保护IgY的稳定性和免疫活性，人们开发了多种封装技术。多糖如壳聚糖和海藻酸盐常被用作IgY的载体，通过脂质体、微胶囊、微凝胶和纳米颗粒等形式进行递送（Alustiza等人，2016年；Dong等人，2022年；Guo等人，2022年；Li等人，2007年）。这些方法中的IgY释放主要依赖于pH值，最佳稳定pH值为1.2（Li等人，2009年）。但在中性pH环境下，聚合物基质容易降解，影响其在食品工业中的应用（Bakhshi等人，2017年）。另一种常见的封装方法是乳液系统，通过凝胶化和去除外部油相来实现药物递送，但IgY主要存在于内部油相中，其封装能力有限（Cho等人，2005年）。相比之下，水-油-水（W1/O/W2）双乳液结构更稳定，在胃酸环境中更耐受消化，能实现活性成分在肠道中的靶向释放（Jiménez-Colmenero，2013年）。IgY具有较高的水溶性，可包裹在内部水相中。本研究创新性地研究了冻融和稀释工艺对IgY理化性质、活性、提取率和提取时间的影响，并建立了稳定的双乳液系统来保护IgY。实验证实了该双乳液在肠道中能有效释放IgY，为口服益生菌的保护提供了一种新策略。
材料
鸡蛋购自湖北联天食品发展有限公司（中国湖北）。PBS ST447、BSA ST025、鸡IgY A7062、TMB显色剂P0211、TMB底物停止液P0215和SDS-PAGE凝胶制备试剂盒P0012A购自贝泰生物科技有限公司（中国上海）。猪胃黏膜提取物S12066、胃蛋白酶S10029、胰酶S10031、胆盐S30895和胃蛋白酶抑制剂S10086购自上海源野生物科技有限公司（中国上海）。Tween 20 P1379
IgY提取工艺分析
采用SDS-PAGE方法分析了IgY提取物的蛋白质组成（图2A）。以鸡IgY标准品（S）作为对照。IgY由两条重链和两条轻链组成，形成Y形结构（Calvert等人，2024年）。分子量分别为74、36和24的条带分别对应IgY的重链、β-卵黄磷脂和轻链（Guilmineau等人，2005年）。纯卵黄（Y）作为另一对照组，其条带分子量分别为221和122 kDa
结论
本文研究了通过冻融过程中冰晶形成使卵黄成分聚集和分离来提取IgY的方法。探讨了工艺流程和冷冻时间对IgY理化性质及活性的影响。新的提取工艺包括冻融-稀释处理，并在-18°C下储存1小时。为防止IgY在消化过程中被破坏，我们优化了相关参数
作者贡献声明
赵正卓：撰写 – 审稿与编辑、原始稿撰写、数据可视化、方法设计、统计分析。刘静云：原始稿撰写、资源准备、实验设计、概念构思。朱新宇：数据验证、实验设计、概念构思。李北溪：数据可视化、结果验证、实验设计。陈金玉：实验实施。周琦：实验设计、概念构思。王子彦：软件应用、数据管理。李艳：撰写 – 审稿与编辑、实验设计。陈一杰：撰写 – 审稿与
未引用文献
Chen, Li, Wang, et al., 2022
Kanonidou, 2021
Zhang, Wang, Li, et al., 2024
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本研究结果的财务利益冲突或个人关系。
致谢
本研究得到了中国湖北省重点研发计划（2023BBB130）、湖北省杰出青年科学基金（2024AFA096）、国家关键技术研发计划（2023YFF1104305）、中央高校基本科研业务费（202662025SPPY004）以及武汉儿童医院科研项目资助（2024FEBSJJ006）的支持。
