在中国栗树中通过全基因组筛选鉴定与DNA结合的单指转录因子基因及其对非生物胁迫的响应

《Frontiers in Plant Science》：Genome-wide identification of DNA-binding with one finger transcription factor genes in Chinese chestnut and their response to abiotic stress

中国栗Dof基因家族通过生物信息学分析鉴定出25个成员（CmDof1-CmDof25），系统发育树显示分为五类群，其中Group3在果实发育中表达较高。顺式作用元件分析表明其含G-box、ABA响应元件等，基因表达模式显示CmDof3、CmDof17在胁迫下表达量显著变化。RT-qPCR验证发现9个基因对高温、低温、遮荫胁迫有差异响应。本研究为解析Dof基因功能及培育抗逆栗树提供分子资源。

　　
中国栗子（Castanea mollissima）Dof转录因子基因家族的鉴定与功能分析

1. 研究背景与意义
Dof（DNA-binding with one finger）转录因子家族是植物特有的一类锌指蛋白，在调控植物生长发育、环境胁迫响应及代谢过程等方面发挥关键作用。已有研究证实Dof蛋白通过C2-C2锌指结构特异性识别AAAG核心序列调控基因表达。尽管该家族在拟南芥、水稻、玉米等模式植物中已有系统研究，但在经济树种中国栗子中的应用研究仍属空白。本研究通过整合基因组学、转录组学和生物信息学方法，首次系统解析中国栗子Dof基因家族的组成与功能特征，为探索木本果树胁迫响应机制提供新资源。

2. 基因家族的系统性鉴定
研究团队通过多维度生物信息学策略，成功鉴定出中国栗子基因组中共包含25个Dof基因（CmDof1-CmDof25）。该方法结合PFam数据库的PF03083隐马尔可夫模型进行初步筛选，再通过InterProScan数据库的跨物种验证，最终确认的基因数量较近缘物种（如美洲栗 Castanea dentata）少约20%。特别值得注意的是，该家族基因在染色体分布上呈现显著特征：10条染色体外仅Chr11和Chr12未发现基因分布，其中Chr2形成包含5个基因的核心簇，而Chr5和Chr6则各有2个基因形成次级簇群。这种分布格局可能与木本植物基因家族的进化模式相关。

3. 蛋白质特征与进化分析
通过Expasy ProtParam和BUSCA数据库的系统分析发现：
- 基因编码蛋白平均长度为328个氨基酸，分子量介于18.68-57.87kD之间
- 等电点（pI）跨度达5.2（4.45-9.65），其中CmDof3具有最低pI值，CmDof17最高
- 不稳定性指数平均为52.36，表明该家族蛋白整体稳定性较低
- 疏水区域分析显示所有蛋白均属亲水性，但CmDof7的亲水性最强（-1.101），CmDof17最弱（-0.388）

系统发育分析揭示该家族存在明确的五组进化分支（Group1-5），其中Group3包含6-8个基因，与水稻Dof家族在Group4的集中分布形成鲜明对比。跨物种比较显示，中国栗子Dof基因与山毛榉（Quercus dentata）的相似度最高（43对同源基因），而与水稻的相似度最低（仅17对同源基因）。这种进化特征提示该家族可能经历了定向基因丢失和功能分化。

4. 基因结构与调控元件特征
通过TBtools进行基因结构解析，发现：
- 32%的基因（8个）不含内含子，14个（56%）含单个内含子，仅CmDof9存在双内含子结构
- 基因外显子-内含子比（E-I比）在0.8-2.3之间波动，其中CmDof10（Chr3）和CmDof22（Chr9）具有典型单内含子结构
- 10个保守基序（Motif1-10）的分布呈现组特异性特征，特别是Motif1（锌指结构域）在所有基因中均存在，而Motif8仅见于Group5

植物CARE数据库的调控元件分析显示，Dof基因启动子区富含环境响应元件：
- 光响应元件（G-box）占比达45.7%，集中在CmDof4、CmDof7和CmDof19
- 激素响应元件（如ABRE、TGA-box）在Group3中密度最高
- 胁迫响应元件（MBS、TC-rich repeats）主要分布于CmDof12和CmDof22
值得注意的是，Group2基因普遍含有5个以上G-box重复序列，可能参与光周期调控。

5. 表达模式与胁迫响应
基于转录组数据分析，发现：
- 花后70-94天，Group3基因（CmDof1、CmDof3等）表达量显著上调，与果实发育阶段高度相关
- 在遮荫处理中，CmDof7、CmDof19等光响应基因在50%-95%遮光强度下呈现剂量依赖性表达
- 高温（45℃）处理4小时后，Group5基因（CmDof6、CmDof11等）表达量平均上调2.3倍
- 低温（-15℃）胁迫下，CmDof25的表达量在15小时时达到基线水平的5倍

RT-qPCR验证显示，9个关键基因（CmDof1、CmDof6、CmDof11等）在三种胁迫下的表达模式存在显著差异：
- CmDof1在高温和低温胁迫下均显著上调（2.1-3.5倍）
- CmDof6在遮荫和低温下分别上调1.8倍和2.3倍
- CmDof11对高温响应最敏感（4.2倍上调）
- CmDof25则呈现相反趋势，在高温和低温下分别下降0.7倍和1.2倍

6. 进化与功能预测
通过Collinearity分析发现：
- 43对内源同源基因（Intra-genomic collinearity）主要涉及染色体区域重叠
- 跨物种比较显示与山毛榉的基因同源性达78%，而与水稻仅为42%
- 基因复制类型分析表明，CmDof家族经历了TRD（转座子复制）和TD（串联复制）主导的进化过程

功能预测方面：
- 15个基因（60%）含有光响应元件（G-box）
- 9个基因（36%）富集激素响应元件（ABRE、TGA-box）
- 7个基因（28%）具有多重胁迫响应元件（MBS、TC-repeats）
特别值得关注的是CmDof7（Group2）同时含有5个G-box和3个MBS元件，可能作为光-旱胁迫交叉调控因子。

7. 应用潜力与研究方向
该研究首次建立中国栗子Dof基因家族的系统数据库，发现：
- 12个基因（48%）在转录组分析中显示多胁迫响应特征
- Group3基因在果实发育阶段表达量最高（FPKM均值达2.1）
- 6个基因（24%）同时具有光响应和激素响应特征
- CmDof19的G-box重复序列数量（5个）为家族之最

未来研究可聚焦：
1) 功能验证：通过CRISPR/Cas9技术敲除关键基因（如CmDof7）观察表型变化
2) 多组学整合：结合代谢组学和蛋白质组学解析Dof蛋白的互作网络
3) 育种应用：利用基因编辑技术增强CmDof25（耐旱）和CmDof1（耐热）的基因表达水平
4) 跨物种比较：重点研究Dof基因家族在壳斗科（Fagaceae）中的进化轨迹

该研究不仅填补了壳斗科植物Dof基因研究的空白，更为开发耐逆性栗树新品种提供了重要的分子标记资源。特别是发现CmDof7在遮荫条件下表达量激增的特性，为研究光环境对木本果树生长调控机制提供了新视角。