FOXA1通过转录激活和表观沉默双重调控RBM47表达抑制结直肠癌上皮-间质转化与转移的机制研究

《Molecular Biomedicine》：Down-regulation of RBM47 due to diminished activation by forkhead box A1 (FOXA1) and silencing by CpG methylation is associated with epithelial-mesenchymal transition and metastasis of colorectal cancer

本研究针对结直肠癌（CRC）转移过程中RBM47表达下调的调控机制这一关键科学问题，通过多组学数据分析、细胞模型功能实验和临床样本验证，揭示了转录因子FOXA1直接激活RBM47转录，而RBM47启动子区CpG甲基化则导致其表达沉默。研究发现FOXA1/RBM47轴通过诱导间质-上皮转化（MET）抑制CRC细胞迁移和侵袭，且RBM47启动子高甲基化可作为转移性CRC的潜在生物标志物，为CRC转移防治提供了新靶点。

　　

在全球范围内，结直肠癌每年导致超过90万人死亡，成为第二大致命癌症，其中超过90%的死亡率归因于肿瘤转移。令人担忧的是，转移性结直肠癌患者的5年生存率不足15%，这凸显了深入理解CRC转移机制对于改善预防和治疗策略的迫切性。

在结直肠癌进展过程中，RNA结合基序蛋白47（RBM47）的表达下调是一个显著特征。RBM47作为一种RNA结合蛋白，通过调节RNA稳定性、剪接和编辑来调控靶基因的转录后表达。尽管先前研究表明RBM47在乳腺癌、肺癌和结直肠癌细胞系及小鼠模型中发挥肿瘤抑制作用，但其在CRC中表达下调的具体机制及其在肿瘤进展中的功能后果尚不明确。

尤其值得注意的是，上皮-间质转化（EMT）及其反向过程间质-上皮转化（MET）在肿瘤转移中扮演着关键角色。RBM47被发现在上皮样癌细胞中高表达，而在间质样癌细胞中表达降低，后者通常具有更强的侵袭和转移能力。然而，驱动RBM47在正常上皮组织中高表达的转录因子以及其在癌症进展中被抑制的机制仍有待阐明。

为了解答这些科学问题，Rokavec等研究人员在《Molecular Biomedicine》上发表了他们的最新研究成果。他们发现叉头框A1（FOXA1）转录因子，一个对内胚层及其衍生上皮组织发育至关重要的调控因子，与RBM47表达呈显著正相关。通过一系列精心设计的实验，研究人员揭示了FOXA1直接结合RBM47启动子区域并激活其转录的分子机制。

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用公共数据库（TCGA、GTEx、CCLE等）进行生物信息学分析；通过染色质免疫沉淀（ChIP）和定量PCR验证转录因子结合；使用RNA干扰和诱导表达系统进行功能获得和缺失实验；通过蛋白质印迹、免疫荧光和qPCR分析基因表达；采用Transwell和小室实验评估细胞迁移和侵袭能力；运用重亚硫酸盐测序和甲基化特异性PCR（MSP）分析DNA甲基化状态；并利用包含43对匹配样本的临床队列（含肝转移患者）进行生物标志物验证。

Association of RBM47 down-regulation in CRCs with metastasis and poor prognosis

研究人员首先通过对12个包含584例CRC患者的队列进行分析，发现与癌旁正常组织相比，10个队列中RBM47在肿瘤组织中显著下调。更重要的是，低RBM47表达与远处转移（M1）显著相关。根据共识分子分型（CMS），RBM47在间质样CMS4亚型中表达最低，该亚型患者预后最差且转移发生率最高。通过患者来源异种移植（PDX）模型排除肿瘤微环境干扰后，研究人员发现RBM47在结直肠癌内在亚型（CRIS）-B中也呈现最低表达。生存分析进一步证实低RBM47表达与较差的无复发生存率相关。

In vivo correlation of RBM47 and FOXA1 expression

通过分析人类蛋白质图谱数据，研究人员发现RBM47蛋白在结肠、小肠、胆囊和肺等内胚层衍生组织中表达最高。基因型-组织表达（GTEx）项目数据分析显示，RBM47与FOXA1表达在不同人体组织中呈显著正相关。在14个原发性CRC和CRC细胞系队列中，FOXA1 mRNA表达与RBM47 mRNA表达呈现一致且显著的正相关。与RBM47类似，FOXA1在结肠癌中相较于癌旁正常组织也呈现一致下调，且在CMS4亚型中表达最低，低FOXA1表达同样与较差预后相关。在细胞系水平，上皮样CRC细胞系（如DLD-1、HCT15）中FOXA1和RBM47表达均高于间质样细胞系（如SW480、SW620）。

RBM47 expression is directly induced by FOXA1

为验证FOXA1是否直接调控RBM47表达，研究人员分析了公共基因表达 omnibus（GEO）数据库中FOXA1过表达/敲低/敲除的数据集，发现大多数研究中RBM47 mRNA在FOXA1过表达后诱导，而在FOXA1敲低后抑制。通过预测，研究人员在RBM47基因座发现了四个推定的FOXA1结合位点。染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR分析证实FOXA1在DLD1和SW620细胞中能与这些位点结合。功能实验表明，在上皮样DLD1和HCT15细胞中敲低FOXA1可显著抑制RBM47 mRNA和蛋白表达，而在间质样SW480和SW620细胞中过表达FOXA1则可诱导RBM47表达。

FOXA1 induces mesenchymal to epithelial transition(MET)via up-regulation of RBM47

接下来研究人员探讨了FOXA1是否通过RBM47调控EMT/MET。发现在上皮样DLD1细胞中敲低FOXA1可诱导间质标志物ZEB1、VIM（波形蛋白）、SNAIL和SLUG的表达，同时降低上皮标志物E-钙黏蛋白（CDH1）的表达。相反，在间质样SW480和SW620细胞中过表达FOXA1可促进细胞从间质向上皮形态转变，抑制VIM和SNAIL表达，诱导CDH1表达。重要的是，通过siRNA敲低RBM47可阻止FOXA1对CDH1的诱导和对VIM、SNAIL的抑制作用，表明FOXA1通过RBM47介导MET过程。

FOXA1 suppresses migration and invasion via RBM47

通过Transwell和小室实验，研究人员发现过表达FOXA1可显著抑制SW480和SW620细胞的迁移和侵袭能力，而敲低RBM47则增强这些细胞的迁移和侵袭。当同时过表达FOXA1并敲低RBM47时，FOXA1对迁移和侵袭的抑制作用被消除，证明FOXA1通过RBM47抑制CRC细胞的迁移和侵袭。

CpG methylation analysis of RBM47

为探究RBM47在间质样CRC细胞系和晚期原发性CRC中持续下调的机制，研究人员分析了53个CRC细胞系中RBM47表达与DNA甲基化的关系。发现大多数上皮样细胞系呈现高RBM47表达和低启动子甲基化，而间质样细胞系则显示低RBM47表达和高启动子甲基化，且两者呈显著负相关。通过重亚硫酸盐测序和甲基化特异性PCR（MSP）验证，发现上皮样DLD1和HCT15细胞中RBM47启动子区CpG位点完全非甲基化，而间质样SW480和SW620细胞中该区域完全甲基化。用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-Aza）处理可重新激活RBM47表达。

CpG methylation of RBM47 is associated with liver metastasis in CRC patients

在包含43对匹配样本的临床队列中，肝转移患者（M1）的原发性CRC显示比无肝转移患者（M0）更高频率和程度的RBM47甲基化。与此一致，RBM47蛋白表达与启动子甲基化呈显著负相关。与之前研究的生物标志物（如MIR34a甲基化、c-MET、SNAIL和β-连环蛋白表达）相比，RBM47甲基化与转移的关联具有更高的比值比、敏感性和特异性。

FOXA1 and RBM47 down-regulation during CRC progression is associated with CpG methylation of RBM47

对多个CRC患者队列的分析显示，FOXA1和RBM47表达从1期到4期结直肠肿瘤中逐渐降低。值得注意的是，RBM47启动子甲基化在正常组织和1期肿瘤中相似，但在更高分期肿瘤中增加，表明RBM47启动子高甲基化并非发生在肿瘤起始阶段，而是在肿瘤进展过程中。

研究结论与讨论部分强调，FOXA1-RBM47轴是CRC中MET的关键调控因子。在正常肠上皮中，高FOXA1表达维持了RBM47的高表达。在早期CRC中，FOXA1和RBM47表达下降，而在转移性4期CRC中，RBM47启动子表观遗传沉默加剧。研究人员提出了一个模型：在早期腺瘤发生期间，FOXA1及随之的RBM47表达下降；在腺瘤向癌进展过程中，RBM47启动子逐渐高甲基化，将最初的RBM47下调表观遗传固定下来。

这一机制的重要性在于FOXA1具有打开浓缩染色质结构的能力，其招募至增强子和启动子与DNA去甲基化和组蛋白H3K4甲基化相关，从而导致转录激活。相反，FOXA1敲低与FOXA1结合区域CpG甲基化增加相关。此外，FOXA1与TET1和TET2 DNA羟化酶相互作用，促进DNA去甲基化。因此，CRC肿瘤发生过程中FOXA1的下调将允许RBM47启动子的CpG甲基化和表达抑制。

该研究还指出，RBM47表达也受其他转录因子调控，如SNAIL、SLUG和STAT3，表明RBM47抑制可能是FOXA1表达减少和STAT3等抑制因子激活共同作用的结果。

最重要的是，本研究确立了RBM47作为FOXA1诱导MET的必要介质，揭示了转录下调（由于FOXA1表达减少）和随后表观沉默（通过CpG甲基化）在CRC进展中的时间顺序。FOXA1和RBM47的下调使得上皮样CRC细胞转变为更具间质样、侵袭性的CRC细胞，最终导致转移形成。此外，RBM47启动子CpG高甲基化作为转移性CRC的潜在生物标志物，为临床诊断和治疗提供了新思路。

这项研究不仅深化了对结直肠癌转移机制的理解，也为开发新的治疗策略和生物标志物提供了重要理论基础，对改善结直肠癌患者预后具有重要临床意义。