Nox3在视网膜神经节细胞和无长突细胞中的表达与功能：对视网膜功能调控及氧化应激损伤的新见解

《Cellular and Molecular Life Sciences》：Nox3 expression and function in retinal ganglion cells and Amacrine cells

本研究聚焦于NADPH氧化酶3(Nox3)在视网膜中的新型表达与功能。研究人员利用Nox3-Cre;tdTomato小鼠模型，首次发现Nox3特异性表达于视网膜神经节细胞(RGCs)和GABA能无长突细胞(ACs)，并证实Nox3源性活性氧(ROS)参与调控视网膜电图(ERG)的STR波、a波和b波。研究揭示在衰老和顺铂处理等病理条件下，过度的Nox3/ROS信号会介导RGCs和ACs的毒性损伤，而Nox3缺失可抵抗顺铂诱导的细胞死亡。该成果为理解Nox3在视网膜生理及年龄相关性与药物毒性视网膜病变中的作用提供了新视角，发表于《Cellular and Molecular Life Sciences》。

　　

在生命体复杂的信号网络中，活性氧（ROS）一直扮演着双重角色：它们既是细胞正常生理活动所必需的信号分子，过量时却又成为推动组织损伤与疾病的“坏分子”。负责产生ROS的NADPH氧化酶（Nox）家族中，Nox3自发现以来一直被广泛认为是内耳的特有成员，其功能缺陷会导致小鼠出现头部倾斜的表型，因为它对于耳石的形成至关重要。然而，科学界对Nox3在身体其他部位，尤其是在精密而脆弱的视网膜中是否表达、有何功能，却知之甚少。视网膜是感知光信号形成视觉的关键组织，其中视网膜神经节细胞（RGCs）和无长突细胞（ACs）的健康与功能直接影响着视觉信号的传递与处理。随着人口老龄化加剧以及某些化疗药物（如顺铂）的广泛应用，年龄相关性和药物毒性的视网膜病变日益成为严峻的健康挑战。探索视网膜中新的氧化应激来源及其调控机制，对于理解这些疾病的病理过程并开发新的干预策略显得尤为重要。

正是在这一背景下，由Takehiko Ueyama博士领导的研究团队在《Cellular and Molecular Life Sciences》上发表了他们的最新研究成果。他们质疑了“Nox3仅在内耳表达”的传统认知，旨在系统性地探索Nox3在视网膜中的表达谱系、生理功能及其在病理条件下的作用。

为了精准追踪Nox3的表达，研究人员构建了巧妙的遗传学工具小鼠——Nox3-Cre;tdTomato小鼠。在该模型中，Cre重组酶基因被敲入Nox3基因的起始密码子（ATG）位点，当与含有loxP-Stop-loxP-tdTomato报告基因的小鼠杂交后，在潜在的Nox3表达细胞中，Cre会切除Stop序列，从而启动tdTomato红色荧光蛋白的表达。这样，发红光的细胞就指示了Nox3可能表达的细胞。利用这种细胞命运图谱技术，结合视网膜扁平铺片和冰冻切片，通过免疫荧光染色鉴定细胞类型，并采用视网膜电图（ERG）评估视网膜功能，最后应用顺铂诱导的毒性模型来探究病理状态下Nox3的作用。

Nox3在视网膜神经节细胞和无长突细胞中的特异性表达

研究团队首先在Nox3-Cre;tdTomato小鼠的视网膜中观察到了清晰的tdTomato阳性信号。令人惊讶的是，这些发出红色荧光的细胞并非均匀分布，而是呈点状聚集。通过视网膜扁平铺片，他们确认这些细胞位于视网膜的神经节细胞层（GCL）。进一步的冰冻切片分析揭示，tdTomato阳性细胞不仅存在于GCL，也出现在内核层（INL）。更为精细的免疫荧光共定位分析显示，GCL中的tdTomato阳性细胞同时表达Pax6、Brn3a和RBPMS，这些都是成熟的视网膜神经节细胞（RGCs）的标志物。而在INL中，tdTomato阳性细胞则与GABA合成酶GAD65共标，但不与胆碱能标志物ChAT共标，表明它们属于GABA能无长突细胞（ACs），这类抑制性中间神经元负责调控RGCs和双极细胞的功能。此外，在视神经中也检测到了tdTomato荧光，进一步印证了Nox3在RGCs及其轴突中的表达。

Nox3表达的时间动态变化：杂合与纯合敲除小鼠的差异

研究人员细致地分析了从出生后7天（P7）到12月龄（12M）的小鼠视网膜中tdTomato阳性细胞数量的变化。他们发现了一个有趣的现象：在Nox3杂合敲除（HT Nox3-KO）小鼠（其Nox3表达水平与野生型相似）中，tdTomato阳性细胞的数量在2月龄时达到峰值并随后趋于稳定。然而，在Nox3纯合敲除（Nox3-KO）小鼠中，tdTomato阳性细胞的数量却呈现出随年龄增长而持续增加的趋势，直至12月龄。这种差异提示，在具有完整Nox3功能的细胞中，Nox3来源的ROS可能对RGCs和ACs本身产生一定的毒性作用，限制了这些细胞的存活或标记的持续性，而在缺乏Nox3的小鼠中，这种毒性压力消失，使得更多细胞能够被标记或存活下来。同时，研究还发现，在视网膜发育完成的关键时间点P21，Nox3-KO小鼠与野生型小鼠在GCL和INL的细胞凋亡（通过TUNEL检测）上没有显著差异，且视网膜的形态结构和厚度也正常，说明Nox3的缺失并不影响视网膜的基本发育。

Nox3缺失导致视网膜电图反应减弱

视网膜电图（ERG）是评估视网膜各层细胞功能的无创客观指标。其中，STR波反映RGCs的功能，a波反映光感受器细胞的功能，而b波则主要反映双极细胞的功能，同时也受到ACs的调制。研究团队对3月龄和6月龄的小鼠进行了ERG检测。结果发现，与野生型小鼠相比，3月龄的Nox3-KO小鼠的STR波、a波和b波的振幅均显著降低。到了6月龄，STR波的降低依然存在，但a波和b波的差异变得不显著。这些结果表明，Nox3来源的ROS对于维持正常的视网膜电生理活动，特别是RGCs相关的功能（STR波）至关重要，其作用在年轻小鼠中更为突出。

Nox3缺失可抵抗顺铂诱导的视网膜细胞损伤

顺铂是一种广泛使用的化疗药物，但其具有明显的耳毒性和视网膜毒性副作用，可导致RGCs丢失、视神经炎等。为了探究Nox3在病理应激下的作用，研究人员用顺铂处理了1月龄、2月龄和6月龄的HT Nox3-KO和Nox3-KO小鼠。结果显示，在2月龄的HT Nox3-KO小鼠（模拟野生型）中，顺铂处理显著减少了视网膜中tdTomato阳性细胞的数量。然而，在相同年龄的Nox3-KO小鼠中，顺铂处理则未引起tdTomato阳性细胞的显著减少。在1月龄和6月龄的小鼠中，顺铂的效应相对较弱或不再显著。这一发现有力地证明，Nox3来源的ROS是介导顺铂诱导的RGCs和ACs毒性损伤的关键因素，而敲除Nox3可以保护这些细胞免受顺铂的侵害。

本研究通过创新的遗传学模型和多种技术手段，首次清晰地描绘了Nox3在视网膜RGCs和GABA能ACs中的特异性表达图谱，颠覆了其仅为“内耳特异性”酶的旧有认知。研究揭示了Nox3在视网膜中的双重角色：在生理状态下，其产生的ROS参与维持正常的视网膜电生理功能；然而，在衰老、顺铂治疗等病理条件下，过度的Nox3/ROS信号则会转变为毒性来源，损害RGCs和ACs。Nox3-KO小鼠表现出ERG波形的异常，特别是STR波的减弱，直接关联到RGCs的功能障碍。更重要的是，Nox3的缺失能够显著减轻顺铂引起的视网膜细胞损伤，这为防治化疗药物相关的视觉毒性提供了潜在的崭新靶点。

该研究的讨论部分进一步深化了这些发现的意义。作者推测，视网膜中Nox3表达的斑片状分布可能与其受到局部炎症因子（如TNF-α）或ROS自身的诱导调控有关。关于Nox3影响ERG a波（光感受器功能）的机制，他们认为可能源于ACs对视觉通路中多突触网络的复杂调制作用。与视网膜中研究较多的其他Nox亚型（如Nox1, Nox2, Nox4）主要参与血管性病变（如糖尿病视网膜病变）不同，Nox3的定位更集中于神经元（RGCs和ACs），提示其在青光眼等神经退行性视网膜病变中可能扮演独特而重要的角色。此外，研究观察到Nox3的功能效应存在年龄依赖性（年轻小鼠更敏感），这与内耳中顺铂的年龄依赖性耳毒性报道相呼应，暗示机体整体的抗氧化防御体系随年龄增长可能发生适应性变化。

综上所述，这项研究不仅拓展了我们对Nox3生物学功能的认识边界，将它的作用从内耳平衡延伸到了视觉感知，更重要的是，它揭示了Nox3/ROS轴在视网膜生理与病理中的精细调控作用。这些发现为理解年龄相关性视网膜功能衰退和药物性视神经病变的分子机制提供了新的理论框架，并提示特异性抑制Nox3活性可能是未来保护视网膜神经元、对抗氧化应激相关眼病的一种有前景的治疗策略。