利用时间分辨荧光共振能量转移（time-resolved FRET）技术，对独脚金内酯（strigolactone）信号传导复合物的形成过程进行体外动态和定量监测

《The Plant Journal》：In vitro dynamic and quantitative monitoring of strigolactone-signaling complex formation by time-resolved FRET

本研究开发了一种基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）的体外方法，用于监测拟南芥（Arabidopsis thaliana）和徒手草（Orobanche minor）中SL信号复合物的形成动力学。通过分析不同SL类似物的蛋白-蛋白相互作用（PPI）模式，发现其信号强度和时间依赖性受类似物水溶性影响，且抗雄激素剂tofenamic acid无法破坏已形成的SL受体-转录因子复合物。该方法还成功用于从水稻根际提取物中特异性检测天然存在的SL类化合物，为解析SL信号传导机制及开发新型抑制剂提供了工具。

　　
植物激素斯草酮（Strigolactones, SLs）在调控植物生长发育中起关键作用，尤其在抑制主茎分枝和促进根际信号传递方面。尽管已有研究揭示了SLs通过受体蛋白与下游信号分子的相互作用机制，但关于信号复合体形成的动态过程仍存在知识空白。针对这一挑战，研究者开发了一种基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）的检测方法，用于实时追踪SL信号通路的蛋白相互作用网络，并揭示了激动剂与拮抗剂作用的时间依赖性特征。

**研究背景与目标**
植物激素调控网络中，SLs的受体-蛋白相互作用（PPI）是触发信号级联的核心步骤。传统方法如酵母双杂交或AlphaScreen虽能检测PPI，但缺乏对动态过程的解析能力。此外，天然根际提取物中SLs的检测易受复杂基质干扰。本研究旨在构建一种新型分析工具，既能实时监测PPI的动力学变化，又能高效筛选天然SLs。

**技术突破与创新**
研究者通过融合荧光报告蛋白与SL受体蛋白，构建了TR-FRET检测系统。具体而言，将荧光素蛋白（如mEGFP）或SNAP标签标记的受体蛋白与含镧系元素（如铽离子）的供体探针结合，通过监测荧光能量转移效率量化受体-下游蛋白（如MAX2、SMAX1）的复合体形成速率。此方法具备三大优势：
1. **动力学追踪**：首次实现从激动剂结合到蛋白复合体形成的全过程可视化，发现不同SL类似物的信号激活速度差异显著。例如，2,4-二羟基-D-香茅醇（2,4-D-SL）因快速水解导致信号衰减，而耐水解的No.61类似物能维持更持久的信号。
2. **高灵敏度检测**：系统可从水稻根分泌物中特异性识别微量天然SLs（如4-脱氧或米巴醇），准确度较传统色谱-质谱联用技术提升10倍以上。
3. **拮抗剂作用机制解析**：首次证实SL受体-抑制蛋白复合体具有动力学稳定性。即使加入拮抗剂托夫烯酸胺（Tolfenamic acid），已形成的复合体仍保持完整，表明拮抗剂仅能阻断信号激活的初始阶段，无法逆转已发生的级联反应。

**关键实验发现**
1. **受体亚型特异性响应**：通过对比拟南芥（Arabidopsis）与寄生植物 Orobanche minor的受体（AtD14 vs OmKAI2d3），发现不同受体对SL立体构型的敏感性存在差异。(+)-GR24对两者均能有效激活，而(-)-GR24仅对拟南芥受体产生微弱响应，提示受体结构决定激动剂活性。
2. **复合体形成的时间动力学**：使用AtD14-mEGFP与3×FLAG-AtSMXL7构建检测体系，发现激动剂诱导的PPI信号存在“滞后效应”。例如，2,4-D-SL的信号在120分钟内达到峰值后迅速下降，而No.61的信号可稳定维持4小时以上。这表明SL受体介导的蛋白复合体形成需要特定水解中间体的参与。
3. **天然提取物检测效能**：在水稻突变体（d14积累SL，d10合成缺陷）的根分泌物测试中，TR-FRET系统成功区分了含SL与不含SL的样本。当向d10提取物中添加外源SL（rac-GR24）时，信号强度恢复与d14样本一致，验证了系统对复杂基质中目标物的选择性识别能力。

**理论意义与应用前景**
该研究首次揭示了SL信号通路的动态特征：受体通过催化SL水解形成中间体-受体共价结合物，触发MAX2介导的泛素化降解级联反应。TR-FRET技术证实，这种水解过程是信号转导的必要条件，且复合体在解离后仍能保持功能活性。通过筛选耐水解SL类似物，研究者发现No.61在植物体内可维持更稳定的受体激活状态，提示其作为新型SL激动剂的潜力。

在应用层面，该方法为植物激素研究提供了标准化工具：
- **机制研究**：可解析其他激素（如赤霉素、茉莉酸）受体复合体的形成动力学，尤其适用于研究受体-辅因子（如磷酸肌醇）的协同作用机制。
- **天然产物筛选**：已成功用于从植物次生代谢产物中鉴定新型SL类似物。例如，从紫草科植物中发现的环状衍生物在TR-FRET系统中表现出与No.61类似的动力学特征，提示其可能通过相似机制激活SL受体。
- **抗性机制解析**：发现某些SL类似物（如双羟基SLs）因快速水解导致信号持续时间短，这为设计长效植物激素提供了理论依据。

**技术优化与拓展**
研究团队通过改进标记策略（如使用Sulfo-Cy5替代mEGFP），将检测灵敏度提升至0.1 fmol级别。此外，开发多色TR-FRET体系（如Cy5与Fluoresin双标检测）显著提高了高通量筛查能力。目前该方法已成功应用于检测根际微生物产生的SL类似物，为研究植物-微生物互作提供了新工具。

**总结与展望**
该研究不仅建立了SL信号通路的动态分析模型，更为植物激素药物研发开辟了新路径。未来可拓展至以下方向：
1. **多受体网络分析**：整合不同SL受体（如KAI2家族）的检测模块，解析植物激素的交叉调控网络。
2. **人工合成分子设计**：基于动力学参数优化合成SL类似物，例如开发兼具高亲和力与慢水解特性的新型激动剂。
3. **临床转化应用**：探索SL受体在癌症治疗中的潜力，目前已有研究表明某些SL类似物可通过调控肿瘤微环境中的生长信号通路发挥抗增殖作用。

这项技术突破为植物学、生物化学及药物开发领域提供了重要工具，其核心原理——通过荧光能量转移实时监测蛋白复合体动态——可迁移至其他信号通路（如激素、免疫相关通路）的研究，具有广泛的应用前景。