CLC3通过调控V-ATPase增强宫颈癌细胞溶酶体降解功能及顺铂耐药性的机制研究

《Cell Death Discovery》：CLC3 regulates V-ATPase to enhance lysosomal degradation and cisplatin resistance in cervical cancer cells

本研究针对宫颈癌(CVC)化疗耐药性难题，探讨了氯离子通道CLC3通过调控V-ATPase活性增强溶酶体酸化和蛋白降解，进而促进肿瘤干细胞特性、抑制细胞凋亡并导致顺铂耐药的分子机制。研究发现靶向CLC3可有效逆转化疗耐药，为克服宫颈癌治疗瓶颈提供了新的潜在靶点和策略。

　　

宫颈癌是全球女性中第四大常见恶性肿瘤，尽管HPV疫苗和筛查项目在预防和早期发现方面取得了显著进展，但晚期宫颈癌的治疗仍然面临巨大挑战，其中化疗耐药性的出现是导致治疗失败的主要原因之一。化疗耐药是一个复杂的多因素现象，涉及遗传、表观遗传和微环境等多种因素。近年来，溶酶体在肿瘤耐药中的作用逐渐成为研究热点。作为细胞内的“消化器官”，溶酶体不仅负责降解废物，还在营养感知、代谢调控和细胞死亡等过程中扮演关键角色。溶酶体功能的正常运行依赖于其内部的酸性环境，而这一环境主要由液泡型H⁺-ATP酶（V-ATPase）通过泵入质子来维持。在癌症进展中，溶酶体酸化常常上调，加速了大分子物质的降解和回收，为癌细胞的快速生长提供了营养支持，同时也可能通过隔离和降解化疗药物而导致耐药。

氯离子通道3（CLC3）是CLC家族成员之一，主要定位于溶酶体等细胞内区室，通过介导氯离子和质子的交换，维持溶酶体膜两侧的电化学梯度，从而支持V-ATPase的活性及其酸化功能。先前的研究表明，CLC3在神经胶质瘤、卵巢癌等多种肿瘤中异常表达，并与肿瘤进展和治疗耐药相关。我们团队前期的研究也证实，CLC3在宫颈癌组织中高表达，并且抑制CLC3能够增强宫颈癌细胞对顺铂的敏感性。然而，CLC3究竟如何通过调控溶酶体功能影响宫颈癌的化疗耐药，其背后的分子机制尚不清楚。为了解决这一问题，研究人员在《Cell Death Discovery》上发表了题为“CLC3 regulates V-ATPase to enhance lysosomal degradation and cisplatin resistance in cervical cancer cells”的研究论文，深入揭示了CLC3在宫颈癌化疗耐药中的关键作用及其机制。

为了回答上述科学问题，研究人员运用了多种细胞分子生物学技术。他们首先检测了多种宫颈癌细胞系中CLC3的表达水平。通过小干扰RNA（siRNA）和过表达质粒分别敲低和上调宫颈癌细胞（如SiHa和CaSKi）中的CLC3表达，评估了其对常用化疗药物（顺铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶）敏感性的影响（通过MTT法计算IC₅₀）。利用荧光探针（SypHer3s和LysoSensor Yellow/Blue DND-160）分别检测了细胞质和溶酶体的pH值。通过蛋白质印迹（Western Blot）分析了自噬（LC3、P62）和凋亡（cleaved caspase-3, caspase-8）相关蛋白的表达。通过集落形成实验、细胞周期检测和干细胞球形成实验评估了细胞增殖和肿瘤干细胞特性。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测了V-ATPase各亚基的mRNA表达。通过免疫共沉淀（Co-IP）验证了CLC3与V-ATPase亚基ATP6V1A之间的相互作用。通过DQ-BSA降解实验评估了溶酶体蛋白降解活性。此外，还建立了小鼠异种移植瘤模型，在体内验证了CLC3调控对肿瘤生长、肺转移及顺铂治疗效果的影响。

CLC3调控宫颈癌细胞的化疗敏感性

研究人员首先发现，与正常宫颈上皮细胞（NCCs）相比，CLC3在多种宫颈癌细胞系（SiHa, MS751, HeLa, ME180, Hela229, CaSKi）中的mRNA和蛋白表达水平均显著上调，尤其在SiHa和CaSKi细胞中表达最高。功能实验表明，敲低CLC3能够显著降低宫颈癌细胞对顺铂、紫杉醇和5-氟尿嘧啶的IC₅₀值，即增强了化疗敏感性；反之，过表达CLC3则提高了IC₅₀值，导致化疗耐药。

CLC3增强溶酶体酸化和蛋白质降解

通过pH荧光探针检测，研究发现过表达CLC3能够促进细胞质碱化和溶酶体酸化（即降低溶酶体pH），而敲低CLC3则效果相反。即使在使用V-ATPase抑制剂Bafilomycin A1（Baf A1）的情况下，CLC3过表达的细胞仍能维持较低的溶酶体pH，提示CLC3可能在一定程度上补偿了V-ATPase功能被抑制后的酸化能力。进一步的DQ-BSA降解实验和Cathepsin B/L的荧光检测均证实，CLC3过表达增强了溶酶体的蛋白降解活性。

CLC3缺陷增强自噬和凋亡

蛋白质印迹分析显示，敲低CLC3后，自噬标志物P62水平下降，LC3-II/LC3-I比值升高，表明自噬流被激活；同时，凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和caspase-8的水平升高，提示凋亡增强。而过表达CLC3则抑制了自噬和凋亡。值得注意的是，使用自噬抑制剂BafA1处理并不能逆转CLC3敲低引起的凋亡增加，使用自噬诱导剂雷帕霉素处理也不能恢复CLC3过表达细胞的凋亡敏感性，表明CLC3对自噬和凋亡的调控可能是相互独立的。

CLC3通过调控V-ATPase调节溶酶体功能

qRT-PCR结果显示，CLC3过表达上调了多个V-ATPase亚基的mRNA表达，尤其是ATP6V1A。免疫共沉淀实验进一步证实了CLC3蛋白与V-ATPase的ATP6V1A亚基之间存在直接的物理相互作用。当使用V-ATPase特异性抑制剂a2v-mAb时，CLC3过表达依然能部分维持溶酶体酸化，并且能逆转a2v-mAb对细胞增殖、干细胞特性标记物（如NANOG, OCT4, KLF4）表达的抑制作用，以及部分恢复对化疗药物的耐药性。这些结果说明CLC3可能通过直接与V-ATPase相互作用，并可能通过其自身的Cl^-/H⁺交换活性，共同调控溶酶体酸化和功能。

CLC3调控肿瘤干细胞特性并抑制凋亡

研究发现，CLC3过表达能够增强宫颈癌细胞的集落形成能力和干细胞球形成能力，并上调干性相关基因的表达。即使在a2v-mAb存在下，CLC3过表达仍能维持较高的细胞活力和干性特征。同时，凋亡实验表明CLC3过表达能抑制化疗药物诱导的细胞凋亡。联合a2v-mAb和CLC3敲低则能最大程度地抑制细胞增殖并增强化疗敏感性。

CLC3敲低体内增强顺铂敏感性并抑制肿瘤生长

在小鼠移植瘤模型中，与单独使用顺铂相比，联合CLC3敲低和顺铂治疗能显著抑制肿瘤体积增长和重量，增加肿瘤组织中的凋亡细胞（TUNEL阳性），降低增殖标志物（Ki-67, Cyclin D1, Cyclin D3）的表达，并有效抑制肺癌转移。相反，过表达CLC3的肿瘤即使在使用顺铂的情况下，仍表现出快速的生长和较强的转移能力。

综上所述，本研究系统阐明了CLC3在宫颈癌化疗耐药中的核心作用。其机制在于：CLC3通过直接与V-ATPase亚基ATP6V1A相互作用并可能通过其离子交换功能，协同维持和增强溶酶体酸化，从而促进溶酶体对蛋白质等大分子的降解能力。一方面，这为癌细胞提供了生存优势；另一方面，增强的溶酶体功能可能通过隔离和降解化疗药物（如顺铂）以及抑制过度的自噬和凋亡，最终导致化疗耐药。此外，CLC3还能通过调节V-ATPase活性来维持肿瘤干细胞特性，进一步加剧耐药和肿瘤复发风险。

本研究的结论部分强调，CLC3是连接溶酶体功能、肿瘤干细胞特性和化疗耐药的关键分子。靶向CLC3或其与V-ATPase的相互作用，有望成为逆转宫颈癌化疗耐药、提高现有化疗方案疗效的新策略。这项研究不仅深化了对宫颈癌耐药机制的理解，也为开发新的联合治疗方法提供了重要的理论依据和潜在的药物靶点。