KRAS G12突变体在HLA-A*11:01中的结构导向分析揭示G12D因长度编码而具有免疫原性优势

《Communications Biology》：Structure guided analysis of KRAS G12 mutants in HLA-A*11:01 reveals a length encoded immunogenic advantage in G12D

本研究针对KRAS G12突变在T细胞免疫疗法中响应差异的难题，通过整合结构生物学与生物物理学方法，解析了不同KRAS G12变异体（包括G12C、G12R、G12V、G12A、G12S和G12D）与HLA-A*11:01形成的pMHC复合物的构象差异。研究发现G12D肽段可呈现为9肽（VVGADGVGK）和10肽（VVVGADGVGK）两种形式，但仅10肽能形成稳定的复合物并被TCR有效识别。该研究揭示了肽段长度和构象对免疫原性的决定性影响，为靶向KRAS G12D的TCR-T疗法设计提供了关键理论依据。

　　

在癌症免疫治疗领域，靶向肿瘤特异性抗原（TSAs）的过继性T细胞疗法，如嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）和T细胞受体工程化T细胞（TCR-T），已经展现出巨大潜力。这些疗法能够精准识别由主要组织相容性复合物I类（MHC-I）分子呈现在肿瘤细胞表面的突变肽段，从而发动免疫攻击。在众多癌基因突变中，KRAS基因第12位甘氨酸（G12）的突变是最常见的驱动突变之一，广泛存在于结直肠癌、胰腺癌和非小细胞肺癌等恶性肿瘤中。这些突变导致KRAS蛋白持续处于激活状态，进而异常活化MAPK和PI3K-AKT等信号通路，促进肿瘤生长。尽管针对KRAS G12突变体的TCR-T疗法已进入早期临床试验，但患者的临床反应存在显著差异，尤其是携带G12D突变的患者往往疗效不佳。这提出了一个关键科学问题：为何源于同一突变位点的不同氨基酸替换，甚至同一突变（如G12D）产生的不同长度肽段，会引发截然不同的免疫识别效果？其背后的结构基础和物理化学机制是什么？

为了回答这些问题，由同济大学附属普陀人民医院麻醉科的赵林林（Linlin Zhao）和徐克（Ke Xu）作为共同通讯作者的研究团队，在《Communications Biology》上发表了他们的最新研究成果。研究人员猜测，不同G12突变可能通过改变肽段-MHC-I（pMHC）复合物的三维构象、稳定性以及其与T细胞受体（TCR）相互作用的界面，从而影响免疫原性。特别是对于在东亚人群中高表达的HLA-A11:01等位基因，其呈现KRAS G12突变肽段的精细机制尚不清楚。因此，他们开展了一项综合性研究，旨在从原子水平揭示KRAS G12突变如何重塑HLA-A11:01的抗原呈递景观。

研究人员运用了多种前沿技术来攻克这一难题。关键技术方法包括：利用溶液核磁共振（NMR）光谱分析pMHC复合物在溶液中的动态构象变化和结合亲和力；通过X射线晶体学解析不同KRAS G12突变肽（G12C, G12R, G12V, G12A, G12S以及G12D 9肽）与HLA-A*11:01复合物的高分辨率三维结构（分辨率在1.79 ? 到 3.1 ? 之间）；采用分子动力学（MD）模拟（使用Desmond软件包，OPLS-AA 2005力场，100 ns模拟时长）来评估G12D 9肽和10肽复合物的稳定性和结合自由能（MM/GBSA计算）；通过细胞实验（在稳定表达特定pMHC的293T细胞系中进行环己酰亚胺（CHX）追踪实验）评估pMHC复合物的稳定性；以及使用流式细胞术分析工程化Jurkat T细胞（表达针对G12D 10肽的TCR）对pMHC四聚体的识别能力。

结果

溶液NMR揭示KRAS-HLA-A11:01复合物的正确折叠和骨架指认*

研究人员首先通过溶液NMR技术验证了重构的HLA-A11:01/β₂M（β₂微球蛋白）/KRAS G12野生型10肽（VVVGAGGVGK）复合物的结构完整性。对均匀标记²H, ¹⁵N, ¹³C的HLA-A11:01重链进行三共振NMR实验，完成了约75%的非脯氨酸残基的骨架指认。谱图显示出良好的信号分散度，表明复合物折叠正确，无聚集。基于化学位移的二级结构预测（TALOS+）结果与已知的HLA-A晶体结构一致，证实了该重组复合物在水溶液中呈现天然构象，为后续研究奠定了可靠基础。

NMR化学位移扰动图谱揭示MHC沟槽中的突变特异性扰动

为了探究不同KRAS G12突变对pMHC构象的影响，研究人员将HLA-A*11:01与六种G12突变肽（G12C, G12R, G12V, G12D, G12A, G12S）分别重构复合物，并采集其¹H-¹⁵N TROSY-HSQC谱图。与野生型复合物相比，所有突变体均引起了HLA重链不同程度的化学位移扰动（CSP）。值得注意的是，不同突变诱导的扰动模式具有特异性：G12C和G12R主要影响α2螺旋的外侧区域；而G12V和G12D则引起更广泛的扰动，延伸至肽结合沟的β片层底部，其中G12D的扰动最为显著。这表明不同G12突变侧链的性质（极性/非极性，大小，电荷）能够独特地重塑MHC分子的局部构象。

KRAS G12突变间不同的肽构象和MHC-I稳定性谱

通过X射线晶体学，研究人员解析了五种KRAS G12突变体（G12C, G12R, G12V, G12A, G12S）与HLA-A*11:01的复合物结构，并结合已发表的G12D 10肽结构（PDB: 7OW4）进行比较分析。结构显示，所有肽段的N端和C端残基在HLA的A和F口袋中的锚定模式是保守的。然而，在突变位点（第12位）附近观察到了显著的结构差异。G12C和G12R的侧链朝向溶剂，而G12V、G12A、G12S和G12D的侧链则伸入肽结合沟内部，与α2螺旋和β片层形成接触。这种构象差异与之前的NMR CSP结果高度一致。进一步的细胞稳定性实验（CHX追踪）表明，与其他G12突变体相比，G12D pMHC复合物的降解速度更快，稳定性更差。

KRAS G12D中的单残基移位重新配置HLA表位以实现选择性TCR识别

针对G12D这一临床挑战，研究人员深入研究了其在HLA-A11:01背景下可被呈递的两种肽段：9肽（VVGADGVGK）和10肽（VVVGADGVGK）。令人惊讶的是，流式细胞术检测发现，特异性识别G12D 10肽的TCR几乎不与G12D 9肽 pMHC四聚体结合（结合信号不足10肽的2%）。为了揭示原因，他们解析了G12D 9肽-HLA-A11:01的晶体结构，并与G12D 10肽结构进行比较。结构对比显示，尽管两端锚定相似，但两种肽段在中心区域构象迥异：在10肽中，天冬氨酸12（Asp12）侧链向内插入结合沟；而在9肽中，Asp12侧链朝向溶剂，且肽段中段（第4-6位残基）发生弯曲，偏离α2螺旋朝向α1螺旋，并与HLA的Thr73形成静电相互作用。这种表面拓扑结构的根本性差异解释了TCR的选择性识别。

分子动力学模拟揭示G12D 10肽相较于9肽的优越稳定性和结合亲和力

分子动力学模拟为上述发现提供了能量学支持。100 ns的MD模拟显示，G12D 10肽复合物的骨架均方根偏差（RMSD）更小，构象更稳定。MM/GBSA结合自由能计算表明，10肽与HLA-A*11:01的结合自由能（ΔG = -122.5 kcal/mol）显著低于9肽（ΔG = -108.1 kcal/mol），表明10肽的结合更紧密、更稳定。这一结果与竞争性NMR滴定实验相互印证：过量10肽可以竞争性置换掉与MHC结合的9肽，而反之则不能。

结论与讨论

本研究通过多学科交叉的方法，系统地阐明了KRAS G12点突变如何通过改变pMHC复合物的结构、稳定性和表面拓扑来影响其免疫原性。研究的核心发现是，对于KRAS G12D突变，肽段长度是一个关键的免疫原性决定因素。在HLA-A*11:01的背景下，G12D 10肽能够形成一种紧凑、稳定且其突变残基（Asp12）埋藏于沟内的pMHC构象，这种构象能被TCR有效识别；而序列高度相似的9肽则因其弯曲的构象和溶剂暴露的Asp12，形成了截然不同的表面形貌，无法被针对10肽的TCR所识别。这种由长度编码的构象差异得到了晶体结构、NMR滴定、分子动力学模拟和细胞功能实验的多重验证。

该研究的发现具有重要的理论和实践意义。首先，它强调了在设计和筛选靶向新抗原的TCR时，不能仅关注肽段序列，还必须充分考虑其被特定HLA等位基因呈递时所采取的具体构象（包括肽段长度和寄存器）。其次，研究揭示了KRAS G12D免疫原性相对较弱的部分结构基础，为其靶向治疗提供了新的思路。未来，基于结构的TCR工程、肽段寄存器的计算机模拟以及机器学习辅助的TCR亲和力预测等策略，可以借鉴本研究提供的原子分辨率结构信息，从而更精准地靶向像KRAS G12D这样难以对付但具有重要治疗价值的共享新抗原，推动下一代个性化癌症免疫疗法的发展。