《Journal of Pharmaceutical Sciences》：Development of HRP-based 3D intercellular exchange assay for high throughput screening
编辑推荐：
细胞间传递纳米颗粒的HRP标记高通量检测平台开发及其在LDN-214117筛选中的应用。
Xian Wu|Xiangxiang Hu|Yiqin Li|Hong-Bo Pang
美国明尼苏达大学药学院药理学系，明尼阿波利斯，MN 55455
摘要
细胞外囊泡（EVs）在介导细胞间通讯和调节过程中发挥着至关重要的作用。通过使用三维（3D）细胞间交换测定法，我们之前已经证明EVs能够在体外促进纳米颗粒（NPs）在细胞间的转移，并且在体内高效传递NPs方面也是必不可少的。该方法进一步被用来识别能够调节细胞间交换过程的小分子。然而，最初的测定法依赖于荧光标记和流式细胞术进行检测，这限制了其适应高通量筛选（HTS）平台的能力。在这项研究中，我们开发了一种基于辣根过氧化物酶（HRP）标记的改进型细胞间交换测定法。具体来说，将能够穿透细胞的肽偶联银纳米颗粒（CPP-AgNPs）用HRP标记，通过HRP与其底物之间的酶促反应实现信号放大。这一改进显著提高了信噪比（S/N），达到了大约6:1。此外，我们还优化了测定系统中的凝胶组成，以确保其与HTS工作流程的兼容性。利用这种基于HRP的测定法，我们验证了LDN-214117这种先前发现的细胞间交换激动剂能够显著促进CPP-AgNPs在各种细胞对之间的转移。总体而言，我们的工作为高通量识别细胞间交换调节因子提供了一个新颖、快速且多用途的平台。
引言
跨细胞转运已被确定为纳米颗粒（NPs）进入肿瘤组织的重要途径1, 2, 3, 4。我们团队之前开发了一种基于胶原蛋白的三维（3D）细胞间交换测定法，用于监测和量化跨细胞NP运输5。利用这一平台，我们证明了细胞外囊泡（EVs）在体外约30–50%的NP跨细胞转移中起作用，并且在体内显著促进了NP在实体肿瘤中的外渗和渗透6。这些发现突显了靶向细胞间交换途径以增强纳米医学在肿瘤中的积累并提高治疗效果的潜力。因此，识别能够调节细胞间交换过程的化合物，从而增加纳米医学在肿瘤中的积累并改善其临床效果，具有很大的价值。
最初使用3D细胞间交换测定法对14种化合物进行了初步筛选6，从中发现了一种ALK-2抑制剂LDN-214117（LDN），它可以增加体外EV介导的细胞间交换以及体内CPP-AgNPs在肿瘤中的积累/渗透。受此结果的鼓舞，我们尝试将我们的测定法与高通量筛选（HTS）技术结合，以进一步提高筛选速度。尽管使用球形测定法（供体和受体细胞在超低结合板上形成球体）和AOD-X文库进行的HTS成功识别出几种有前景的“命中”化合物，但筛选通量受到检测步骤的限制，该步骤依赖于流式细胞术来测量荧光染料标记的银纳米颗粒（AgNPs）和GFP标记的细胞，而流式细胞术本身是一个耗时的过程。
为了解决这一限制，我们旨在开发一种更快速且可扩展的检测方法。辣根过氧化物酶（HRP）是一种常用于ELISA和HTS应用中的酶7, 8, 9, 10，它具有高信噪比、快速周转率以及与多种检测格式的兼容性。当与常用的底物如3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）11, 12、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）13, 14或3,3′-二氨基联苯胺（DAB）12, 15结合时，HRP会产生可通过标准平板读取器快速量化的比色信号，非常适合HTS。然而，由于平板读取器无法像流式细胞术那样区分供体和受体细胞群体，因此还需要一种新的凝胶系统，以便HTS系统能够快速分离供体和受体细胞。
在这项工作中，我们通过将HRP与CPP-AgNPs结合，使其适应HTS兼容性，作为模型NP系统。此外，我们使用胶原蛋白和藻酸盐凝胶开发了一种二元凝胶系统，以确保两种细胞群体的完全和快速分离，从而提高了测定法的准确性和通量。最后，我们通过手动评估两种化疗药物多柔比星（DOX）和吉西他滨（GEM）对EV介导的细胞间交换的影响，评估了新测定法的性能。这些实验证明了该系统的特异性、敏感性和重复性，支持其在高通量筛选细胞间通讯调节因子方面的潜在用途。
部分摘录
HRP无法穿透细胞膜
由于本研究关注的主要途径是EV介导的细胞间交换，而任何自由释放的AgNPs都会被测定液中的蚀刻剂迅速溶解5，因此测定法可靠性的一个关键前提是来自蚀刻AgNPs的信号基团必须保持对细胞膜的不可渗透性。为了评估游离HRP是否能够穿透细胞膜，将PC-3细胞与1 μM HRP共培养过夜，并在条件培养基（CCM）中进行比色反应
讨论
在这里，我们旨在开发一种多用途的3D细胞测定法，用于以HTS方式筛选潜在的调节EV介导的细胞间交换的化合物。我们已经证明，通过用HRP标记CPP-AgNPs，可以替代原始的耗时检测方法（流式细胞术），使用标准平板读取器进行检测，这种方法更符合HTS工作流程。此外，还优化了二元凝胶系统，以实现快速和标准化的洗涤过程
结论
我们开发了一种新型的、兼容HTS的3D测定法，能够量化EV介导的纳米颗粒跨细胞交换。该测定法结合了二元凝胶培养平台和基于HRP的比色检测系统，在通量、重复性和自动化潜力方面都有显著改进。其在化疗筛选中的应用证明了其在识别EV介导的运输调节因子方面的实用性
材料
I型胶原蛋白（大鼠尾腱高浓度，8.91 mg/mL，参考编号354249）从Corning购买。海藻酸钠（参考编号w201502-1kg）从Sigma Aldrich购买。BHRP-Biotin（参考编号432040）、1-Step? TMB ELISA底物溶液（34022）和AlgiMatrix?溶解缓冲液（A1134001）从Thermo Fisher购买。ImmPACT DAB过氧化物酶（HRP）底物（SK-4105）和AEC HRP底物试剂盒（红色）用于IHC（SK-4200）从Vector购买。
作者贡献
H-B.P.设计了该项目。X.W.、XX.H和Y.L.完成了其余的研究工作。X.W.和H-B.P.撰写了手稿。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可应相应作者的要求提供。
利益声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本研究得到了明尼苏达大学药学院和Masonic癌症中心提供给Pang博士的内部资金支持。作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
