《Surfaces and Interfaces》：Fe
3O
4@Phe@Lipase Floating Microspheres Accelerate Oil-Water Interfacial Catalysis
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本研究通过合成苯基修饰的磁性纳米颗粒，利用疏水-静电协同作用提高脂肪酶负载量和稳定性，并采用空心微球3D打印技术精准定位油水界面，使催化效率提升1.86倍，且在极端条件下表现优异，适用于工业脂类水解和水域污染治理。
霍布青 | 周宣宏 | 黄晓辉 | 刘天慈 | 余浩洲 | 黄子寅 | 孙清月 | 陈世宏 | 张晓军 | 龙瑞敏 | 石朝彪 | 陈国
华侨大学化学工程学院，中国厦门集美大道668号，361021
摘要
虽然脂肪酶提供了一种环保且高效的脂质降解方法，可以减轻水borne脂质污染，但自由脂肪酶在工业环境中的实际应用往往受到其固有不稳定性和对油水界面激活依赖性的限制。为了解决这些问题，本研究提出了一种创新策略，基于合成苯丙氨酸修饰的磁性纳米粒子（Fe?O?@Phe），利用疏水-静电协同作用实现高脂肪酶负载量和稳定的固定化。Fe?O?@Phe中的疏水苯丙氨酸部分被特别设计以模拟油水界面微环境，从而提高催化效率。此外，我们巧妙地采用中空微球集成3D打印技术制备了Fe?O?@Phe@Lipase漂浮微球，使固定化的脂肪酶能够精确地定位在油水界面，使得反应效率比非漂浮型Fe?O?@Phe@Lipase提高了1.86倍。重要的是，Fe?O?@Phe@Lipase漂浮微球在各种极端条件下表现出优异的稳定性，包括不同的pH值、高温和变性剂。这些特性使它们非常适合用于水生环境中的脂质污染修复和工业脂质水解，无需机械搅拌或乳化。这项研究不仅展示了通过微环境模拟在氨基酸功能化磁性纳米粒子上固定酶的有前景的策略，还引入了一个灵活的组装平台，用于调节催化剂密度和提高催化效率。所描述的方法在广泛的界面反应和多种催化剂用于脂质污染控制方面具有显著潜力。
引言
脂肪酶是一种多功能生物催化剂，能够催化甘油三酯的水解、酯化和转酯化反应，以脂质作为唯一的碳源[1,2]。它们来源于富含脂质的微生物环境，如废水和油厂排放物[3]，广泛应用于食品加工[4]、生物柴油生产[5,6]、药物合成[7]和环境修复[8]。值得注意的是，脂肪酶提供了一种环保的解决方案，可以将食品服务和工业活动中的油污降解为无害的甘油和脂肪酸[9]。在大型水生环境中，例如海洋系统中，来自铜绿假单胞菌等微生物的脂肪酶能够高效降解总石油烃，这一效果还得到了生物表面活性剂的增强[10]。这优于焚烧和过滤等成本高昂且污染严重的物理化学方法[[11], [12], [13], [14], [15], [16]]。
然而，脂肪酶的催化效率依赖于油水界面，在该界面处脂肪酶的构象变化会最大化其活性[[17], [18], [19], [20]]。在大量水中，大多数自由脂肪酶仍存在于亲水相中，减少了底物的接触机会。在大规模水生环境中，由于分散、盐度变化、pH值波动以及污染物生物利用率低等原因导致界面不稳定，这一问题更加严重，同时酶的不稳定性和回收也存在挑战[[21], [22], [23]]。界面依赖性与界面不稳定性之间的矛盾，加上酶的性能限制，限制了其可扩展性，需要创新解决方案。
化学修饰[24]和合理的蛋白质设计[25]可以提高脂肪酶的稳定性和活性。将其固定在磁珠或凝胶等载体上可以增强其稳定性和可重复使用性[[26], [27], [28]]。然而，传统的共价交联或包封方法会限制其移动性和底物接触，阻碍其在界面处的定位和活性发挥[[29], [30], [31]]。本研究引入了界面定位固定化技术，以在油水界面维持酶的活性和稳定性，解决了界面依赖性与实际可扩展性之间的关键差距，从而实现有效的水生环境中的脂质降解。
在本研究中，我们合成了Fe?O?@Phe纳米粒子，通过苯丙氨酸基团将其固定在磁珠上，利用了静电和疏水作用的协同效应（方案1a）。这种方法显著提高了脂肪酶在磁珠表面的负载量和稳定性。苯丙氨酸的芳香疏水结构创建了一个疏水微环境，有助于底物的疏水吸附，可能增强催化效率[20]。
此外，在大规模水生环境中，通过人工搅拌或乳化建立有效的油水界面以促进脂质降解是具有挑战性的[32]。由于脂质降解反应主要发生在油水界面，因此将脂肪酶分子定位在该界面是实现高效催化的最佳方式。因此，我们创新性地使用了低密度中空玻璃微球来调节Fe?O?@Phe@Lipase海藻酸钙微球的密度，确保大多数封装的酶参与油水界面上的水解反应（方案1b）。这项研究不仅提供了一种合成氨基酸修饰磁性纳米粒子以固定酶并模拟其催化环境的潜在策略，还引入了一种加速界面反应的新方法。
材料
VII型脂肪酶、海藻酸钠和50 mM Tris-HCl缓冲液购自北京Solarbio科技有限公司。聚乙烯醇1750（99%，AR）和氨溶液来自新华制药试剂有限公司。磷酸二氢钾和十二水合磷酸二钠购自上海Titan科技有限公司。氢氧化钠（AR）和无水乙醇由天津永大化学试剂有限公司提供。橄榄油（AR）
Fe?O?@Phe的合成与表征
首先，通过一锅法合成了各种氨基酸修饰的Fe?O?纳米粒子[[33], [34], [35], [36]]，并在吸附时间为15分钟、脂肪酶浓度为1 mg/mL、磁珠浓度为5 mg/mL的条件下比较了它们的脂肪酶负载能力（图1a）。实验结果表明，用疏水氨基酸Phe和Pro修饰的Fe?O?的脂肪酶负载能力显著高于未修饰的Fe?O?
结论
本研究介绍了利用苯丙氨酸功能化的磁性纳米珠进行脂肪酶固定化的方法，通过疏水和静电作用的协同效应显著提高了酶的负载量和稳定性。通过集成3D打印的Fe?O?@Phe@Lipase漂浮微球，脂肪酶能够精确地定位在油水界面，显著提高了pH稳定性、热稳定性和抗变性能力，优于自由脂肪酶。封装在保护性的Fe?O?@Phe核心中
资助
本工作得到了中央高校基本科研业务费（资助编号ZQN-1210）、国家自然科学基金（资助编号22307040）、厦门市自然科学基金（资助编号3502Z20227035）以及华侨大学科研经费（资助编号21BS123）的支持。
CRediT作者贡献声明
霍布青：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、监督、软件、项目管理、方法论、正式分析、数据管理、概念构思。周宣宏：可视化、验证、监督、软件、方法论、正式分析、数据管理。黄晓辉：验证、数据管理、调查、可视化。刘天慈：验证、数据管理。余浩洲：验证、调查、软件。黄子寅：验证
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作
