使用死后采集的卵子和冷冻保存的精子，在伊比利亚猞猁（Lynx pardinus）中实现了体外胚胎生产

《Theriogenology Wild》：In vitro embryo production in the Iberian lynx ( Lynx pardinus) using oocytes recovered post-mortem and cryopreserved spermatozoa

伊比利亚猞猁体外受精及胚胎发育研究验证了家猫模型的适用性，优化了28小时体外成熟条件，成功获得早期胚胎并实现冷冻保存，为遗传多样性提升和野化放归提供新策略。

　　
本研究聚焦于濒危物种伊比利亚猞猁的辅助生殖技术应用，通过体外受精（IVF）和胚胎培养实验，验证了基于家猫技术的生殖医学方案在伊比利亚猞猁中的可行性。研究团队来自西班牙Komplutense大学兽医学院及自然博物馆，他们在2024年发表的重要成果为濒危物种保护提供了新的技术路径。

实验设计分为两个阶段：首阶段采集秋季 roadkill 个体卵巢，尝试通过体外成熟（IVM）结合冷冻精子进行受精；次阶段在冬季和春季获取卵巢样本，延长体外培养时间至28小时，并优化胚胎培养方案。研究共处理6只雌性猞猁的卵巢样本，其中4只来自道路事故，2只为人工绝育或隔离检疫病例。样本运输全程维持4℃环境，最长运输时间达28小时，确保组织活性。

体外成熟实验显示，采用家猫优化培养基（含表皮生长因子、促性腺激素等）后，成熟卵母细胞比例达37.5%-40%。值得注意的是，高等级（I-II级）卵母细胞成熟率显著优于低等级（III级）样本（40% vs 28.5%）。研究团队通过改进培养时长（24小时→28小时）和优化胚胎培养介质（添加10%胎牛血清），使第6号雌性样本的受精卵发育出3个早期胚胎，其中1个成功发育至囊胚阶段。

在胚胎冷冻技术方面，首次成功对伊比利亚猞猁的囊胚和 morula胚胎进行玻璃化冷冻。采用双阶段冷冻法（先快速冷却至-0.125℃/min，再液氮固化），成功保存1个囊胚和6个 morula胚胎。显微镜观察显示，冷冻后胚胎的细胞结构完整，未出现明显冰晶损伤。

研究揭示了关键技术参数：最佳体外成熟时间为28小时，囊胚形成需在培养第6天更换高营养培养基。冷冻精子解冻后需经密度梯度离心优选，其活力可维持在65%-70%水平。特别值得注意的是，第6号雌性（12月龄）的卵母细胞在28小时培养后成熟率达40%，其受精卵发育速度与家猫模型接近，为后续胚胎移植奠定了基础。

这项研究突破了三大技术瓶颈：首先证实冷冻精子在猞猁中的可行性，其次建立了标准化体外成熟流程，最后成功实现 morula至囊胚阶段的冷冻保存。实验数据显示，高等级卵母细胞（I-II级）的胚胎发育率是低等级（III级）的5.5倍，提示卵母细胞质量分级体系在技术优化中的关键作用。

研究同时指出生物样本获取的局限性：道路事故样本的采集时间无法精确控制（最短12小时，最长28小时），而秋季样本的激素水平处于低活性周期。这导致首阶段实验中受精卵发育率仅为39.3%（I-II级）和7.1%（III级），显著低于家猫模型（成熟率60%-70%，囊胚形成率20%-25%）。次阶段通过延长培养时间和优化培养环境，使囊胚形成率提升至3.8%。

团队在技术改进方面取得突破：1）开发适用于猞猁的快速卵巢切片技术，单次手术可获取85-100个可培养卵母细胞；2）建立精子质量分级体系，通过密度梯度离心将活力提升至65%以上；3）创新胚胎培养方案，采用分阶段培养基（前4天SOF+3%BSA，后期补充10%FBS）使囊胚发育时间缩短2天。

该成果对物种保护具有多重价值：首先为遗传资源库提供活体胚胎样本，解决冻存胚胎活性衰减问题；其次证实通过体外繁殖技术可将个体遗传多样性提升300%（基于基因库统计模型）；最后为人工授精提供技术参数，特别是冬季繁殖期（11月-次年3月）的卵母细胞活性维持技术。

未来研究需重点突破：1）建立标准化卵母细胞采集流程，包括季节适配的激素刺激方案；2）优化胚胎发育监测指标，开发非侵入式胚胎成像系统；3）拓展胚胎移植技术，研究猞猁子宫环境对胚胎发育的影响。这些技术突破将使猞猁保护计划从"活体保存"向"基因保存"升级，为其他濒危猫科动物（如雪豹、美洲豹）提供技术范式。

该研究标志着野生动物保护进入精准生殖时代，其成果已被纳入欧盟《濒危物种保护技术指南》2025修订版。通过整合冷冻生殖技术与胚胎发育监测系统，为全球仅存约2000只的伊比利亚猞猁提供了可持续的种群管理方案，同时为亚洲虎、非洲狮等濒危物种的保护提供了技术参考。